簡葉葉 李慶旺 莊培榮

摘 要：本文通過單因素實驗和正交實驗對燕碎中唾液酸酶法提取工藝進行優(yōu)化。實驗得到酶法提取唾液酸的最優(yōu)工藝參數(shù)為：酶解時間2.5 h，液料比35∶1（mL∶g），溫度45 ℃，pH為7.5，并以此為條件制備出燕窩濃縮液。

關鍵詞：燕碎;唾液酸;酶法

Abstract：In this paper， single factor experiment and orthogonal experiment were used to optimize the extraction process of sialidase in fragmentary cubilose. The optimum technological parameters of extracting sialic acid by enzymatic method were obtained： enzymatic hydrolysis time 2.5 h， liquid-to-material ratio 35∶1 （ml∶g）， temperature 45 ℃， pH 7.5， and then the birds nest concentrate was prepared.

Key words：Fragmentary cubilose; Sialic acid; Enzymatic method

為研究如何較好地提取保留燕碎中的有效功能成分唾液酸，本文采用木瓜蛋白酶酶法提取燕碎中的唾液酸。單因素實驗研究了加酶量、液料比、溫度、酶解時間和pH等因素對燕碎中唾液酸提取率的影響，以此為基礎，進行正交實驗優(yōu)化，確定酶法提取燕碎中唾液酸的最佳工藝條件，進而制備出燕窩濃縮液，為燕碎的應用開發(fā)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

燕碎（原產(chǎn)馬來西亞）;唾液酸標準品（Sigma公司）;木瓜蛋白酶（酶活力為2.5×106 u·g-1;硫酸銨、95%乙醇、NaOH、茚三酮、冰醋酸。

1.2 儀器

紫外可見分光光度計（型號：WFZUV-2000，尤尼科上海儀器有限公司）;水浴恒溫振蕩器（型號：THZ-82，常州國華電器有限公司）;臺式高速冷凍離心機（型號：HI850R，湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司）;數(shù)顯恒溫水浴鍋（型號：HWS，上海晶壇儀器制造有限公司）

1.3 實驗方法

1.3.1 酶法提取工藝

準確稱取一定質(zhì)量的燕碎，按一定比例加入蒸餾水，調(diào)節(jié)pH，添加適量木瓜蛋白酶，放入恒溫水浴鍋中，酶解一定時間后，沸水浴滅酶10 min[1]。用比色法測定酶解液的吸光值，計算唾液酸提取率。

1.3.2 燕窩中唾液酸提取率的測定方法

測定方法參照陳昕露[1]第四章唾液酸提取率的具體步驟進行測定。

1.3.3 單因素實驗

為研究加酶量、液料比、溫度、酶解時間和pH等因素[1-2]對燕窩酶解液中唾液酸提取率的影響，分別開展單因素實驗，因素水平表見表1。

1.3.4 正交實驗

根據(jù)單因素實驗結果，選取4個對唾液酸提取率影響較大的因素進行正交實驗，分析各因素對唾液酸提取率的綜合影響，以確定木瓜蛋白酶酶法提取燕窩唾液酸最佳工藝參數(shù)。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 液料比對燕碎中唾液酸提取率的影響

在加酶量2%，溫度50 ℃，酶解時間2 h，pH 7的條件下，選取液料比（mL：g）分別為10∶1、20∶1、30∶1、40∶1和50∶1，對唾液酸的提取率進行實驗。由圖1知，燕碎的唾液酸提取率在30∶1（mL∶g）時達到最大值，提取率隨液料比增加而增大，但當液料比超過30∶1（mL：g）時，提取率反而有所下降。所以選取最佳液料比為30∶1（mL∶g）。

2.1.2 加酶量對燕碎中唾液酸提取率的影響

在液料比30∶1（mL∶g），溫度為50 ℃，酶解時間為2 h，pH 7的條件下，選取加酶量分別為2.5%、3.0%、3.5%、4.0%和4.5%，對唾液酸的提取率進行實驗。由圖2可知，當加酶量介于2.5%～4%，燕碎中的唾液酸提取率隨加酶量增加而升高。隨著加酶量的增加，酶對底物的作用增強，唾液酸不斷酶解溶出，提高了唾液酸提取率。當加酶量大于4.0%，提取率不再增加。因此，加酶量4%是較經(jīng)濟的選擇。

2.1.3 溫度對燕碎中唾液酸提取率的影響

在液料比30∶1（mL∶g），加酶量4%，酶解時間2 h，pH 7的條件下，選取溫度分別為30、40、50、60 ℃和70 ℃，對唾液酸的提取率進行實驗。由圖3知，酶解溫度對唾液酸的提取率影響很大。在30～50 ℃時，唾液酸提取率隨溫度上升而升高，在50 ℃達到最大值。在50～70 ℃，唾液酸的提取率隨溫度的升高呈下降趨勢。原因可能是實驗溫度過高，木瓜蛋白酶失去活性降低了酶解過程，唾液酸無法溶出，導致唾液酸提取率逐漸降低。所以最好控制酶解溫度在50 ℃左右。

2.1.4 酶解時間對燕碎中唾液酸提取率的影響

在液料比30∶1（mL∶g），加酶量4%，溫度為50 ℃，pH 7的條件下，選取酶解時間分別為0.5、1.0、2.0、3.0 h和4.0 h，對唾液酸的提取率進行實驗，。由圖4知，在0.5～2 h內(nèi)，唾液酸的提取率急速上升，酶解時間為2 h時提取率最大，之后趨于平緩。原因可能是剛開始隨著酶解時間的增加，底物慢慢酶解，故唾液酸提取率也升高，酶解時間為2 h時，燕碎中唾液酸充分酶解溶出達最大值。而后隨著酶解時間繼續(xù)延長，唾液酸不再溶出，提取率不變。所以，最佳酶解時間為2 h。

2.1.5 pH對燕窩中唾液酸提取率的影響

在液料比30∶1（mL∶g），加酶量4%，溫度為2 h，酶解溫度為50 ℃的條件下，選取pH分別為6、7、8、9、10，對唾液酸的提取率進行實驗。由圖5知，在pH在7以下，隨著pH升高，唾液酸提取率逐漸升高，pH在7時達到最高點;當pH介于7～10，唾液酸提取率逐漸降低。因此，確定木瓜蛋白酶在酶法提取唾液酸中的最適pH為7。

2.2 正交實驗結果分析

根據(jù)2.1實驗結果，選取液料比、溫度、酶解時間和pH進行四因素三水平正交實驗，按L9（34）正交設計表，正交因素水平見表2，正交實驗結果及數(shù)據(jù)分析見表3。固定條件為：加酶量4%。由表3知，4個因素對燕碎唾液酸木瓜蛋白酶酶解提取的影響大小為：C>A>B>D，即酶解時間>液料比>溫度>pH。由k值得最優(yōu)組合為A3B1C3D3，即：酶解時間2.5 h，液料比35∶1，溫度45 ℃，pH為7.5，得到唾液酸提取率為（9.48±0.04）%，高于正交實驗表中的任何一組。

2.3 燕窩濃縮液制備

以上述2.2的實驗結果為依據(jù)，在液料比35∶1，酶解時間2.5 h，酶解溫度45 ℃，pH為7.5制備燕碎的酶解液。利用真空濃縮法[3]，控制濃縮溫度（30～60 ℃），時間（45～150 min）和壓力（1～12 kPa），對燕窩酶解液進行真空濃縮。經(jīng)此步驟后的燕窩濃縮液，與原本的燕窩酶解液相比約有90%水分被移除，而燕窩的營養(yǎng)成分仍得以保留。

3 結論

對燕碎中唾液酸酶法提取工藝進行單因素實驗，得到最佳液料比30∶1（mL∶g）、酶解溫度50 ℃、酶解時間2 h和pH 7，加酶量4%為宜。并在單因素實驗基礎上進行正交實驗。實驗發(fā)現(xiàn)酶法提取唾液酸的最優(yōu)工藝參數(shù)為酶解時間2.5 h，液料比35∶1（mL∶g），溫度45 ℃，pH為7.5，得到的唾液酸提取率為（9.48±0.04）%。并以此條件制備出了一款營養(yǎng)價值高保留的燕窩濃縮液。

參考文獻：

[1]陳昕露.不同加工條件對燕窩唾液酸提取效果的影響及燕窩功能特性的研究[D].福州：福建農(nóng)林大學，2013.

[2]王 煥，秦英杰，劉立強，等.多效膜蒸餾技術用于果汁濃縮[J].化學工業(yè)與工程，2012，29（4）：50-57.

[3]陳 婕.橄欖濃縮汁加工技術的研究[D].福州：福建農(nóng)林大學，2012.