馬珍珍 王麗琴 張亞旭 由蕊 郭芷彤 楊璐

摘要利用掃描電子顯微鏡（SEM）、X射線衍射法（XRD）和紅外光譜法（FTIR）對豬皮膠、全蛋、蛋清、蛋黃、牛奶5種常見彩繪文物蛋白膠料老化前后的形貌、結(jié)晶度、紅外光譜吸收特征和蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)含量進行了對比研究。結(jié)果表明，5種膠料老化后，表面規(guī)則的結(jié)構(gòu)和紋理遭到破壞，整體變得松散;結(jié)晶度降低，尤以牛奶最顯著;老化后，5種蛋白膠酰胺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ帶紅外吸收的階梯狀特征仍然明顯，但螺旋結(jié)構(gòu)已經(jīng)解離，且均呈現(xiàn)α螺旋含量降低、β折疊和無規(guī)則卷曲含量增高的趨勢，說明分子結(jié)構(gòu)從有序趨于無序狀態(tài)。

關(guān)鍵詞形貌; 結(jié)構(gòu); 蛋白膠料; 土壤埋藏老化; 彩繪文物

1引 言

蛋白類物質(zhì)來源廣， 易獲得，是古代彩繪文物最常見的膠料[1，2]，作為顏料的分散和固定劑，也是彩繪文物色彩穩(wěn)定存在的關(guān)鍵物質(zhì)[3]。我國擁有大量珍貴的考古出土彩繪文物，土壤埋藏降解是其出土前的主要老化形式，會改變蛋白膠料的形貌和結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致彩繪顏料層出現(xiàn)粉化、脫落等病害[4]，降低文物的藝術(shù)價值，早期秦兵馬俑彩繪脫落就是一個典型的例子。由于蛋白膠料形貌和結(jié)構(gòu)的改變，極大影響了蛋白膠料鑒定的準(zhǔn)確性和保護材料的選擇，成為制約彩繪文物有效保護的瓶頸問題之一。按照“不改變文物原貌”的文物保護基本原則，要求盡可能使用原有材料進行保護。因此，蛋白膠料的準(zhǔn)確鑒定是正確選擇保護材料和實施保護的前提和基礎(chǔ)，對彩繪文物保護具有重要指導(dǎo)意義。

掃描電子顯微鏡（SEM）、紅外光譜法（FTIR）和X射線衍射法（XRD）等技術(shù)是常用的材料表征手段[5，6]，近年來已用于有機質(zhì)文物形貌觀察、結(jié)構(gòu)分析及文物保護中。例如，利用SEM觀察絲織品圖案金屬化過程中Ag的沉積[7]，并用于評估不同方法對紙張中老化動物膠的清理效果[8]。Sotiropoulou等[9]利用FTIR研究希臘史前時期、羅馬時期墓葬壁畫材質(zhì)成分，獲取了彩繪層蛋白膠料的紅外吸收光譜特征信息; 絲綢室內(nèi)自然老化和人工紫外老化的研究表明，絲綢蛋白無定形區(qū)發(fā)生氧化、二級結(jié)構(gòu)變化使得晶體結(jié)構(gòu)規(guī)則度降低[10]。XRD作為獲取生物大分子結(jié)構(gòu)的主要技術(shù)之一[11]，也用于文物加固材料性能的表征，Hao等[12]指出，老化絲織品經(jīng)加固后，結(jié)晶度提高、微缺陷被修復(fù)，結(jié)構(gòu)排列逐步規(guī)則化。本研究以中國古代彩繪文物最常見膠料豬皮膠、蛋類和牛奶[13]為研究對象，利用上述方法探討了膠料在土壤埋藏老化前后的形貌、結(jié)晶度、FTIR吸收特征及二級結(jié)構(gòu)的變化，為文物蛋白膠料的準(zhǔn)確鑒定和保護修復(fù)材料的選擇奠定了科學(xué)基礎(chǔ)。

2實驗部分

2.1儀器、試劑與材料

VEGA3XM鎢燈絲型掃描電子顯微鏡（捷克泰斯肯公司）; Smart LAB型X射線衍射儀（日本理學(xué)株式會社）; Bruker Tensor 27型FTIR光譜儀（德國布魯克公司）; PP20E手動電動一體式壓片機（天津瑞岸科技有限公司）; MasterS HitechSciencetool實驗室超純水系統(tǒng)（上海和泰儀器有限公司）。

氨水（色譜純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）; KBr粉末（光譜純，天津天光光學(xué)儀器有限公司）; 乙醇（分析純，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）; 鐵粉（分析純，天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠）; 蛋白膠料：市售全蛋、蛋清和蛋黃（機械分離全蛋獲得），銀橋全脂牛奶，豬皮膠依據(jù)《齊民要術(shù)》所述傳統(tǒng)制膠技術(shù)由市售新鮮豬皮熬制[14]。

2.2蛋白膠樣的制備及樣品前處理

2.2.1新鮮蛋白樣品的制備稱取不同質(zhì)量的豬皮膠（含蛋白85%）、全蛋（含蛋白12.8%）、蛋清（含蛋白11.5%）、蛋黃（含蛋白17.5%）和牛奶（含蛋白3%），使其均含有0.6 g蛋白。蛋白樣品用超純水溶解后于載玻片上成膜，陰干至水份完全揮發(fā)后，備用。每種膠制備2組，其中一組按照2.2.3節(jié)處理后作為新鮮蛋白樣品，另一組按照2.2.2節(jié)處理后作為老化蛋白樣品。

2.2.2老化蛋白樣品的制備取墓葬底土層土若干（本實驗用土取自陜西韓休唐墓新鮮開挖的墓葬土，離地表10 m深），參考文獻[15]的方法進行樣品的土壤埋藏，具體如下：經(jīng)分樣篩（孔徑0.2 mm）過篩后排除大顆粒土塊等雜質(zhì)，于255℃下滅菌處理24 h，加超純水制得含水率12%的滅菌土樣，裝入玻璃罐中。將2.2.1節(jié)制備的另一組膠樣埋入土中，并在上、中、下層分別鋪置10%的鐵粉，將土壓實、擰緊罐蓋并用蠟密封罐體，遮黑后于5℃存放，使樣品處于缺氧、避光、低溫、密閉的穩(wěn)定環(huán)境中，以模擬彩繪文物在土壤埋藏中的老化狀態(tài)。埋藏一年后，清除膠樣表面的土，按2.2.3節(jié)處理后，制得老化蛋白樣品。

2.2.3樣品前處理分別取1 g土壤埋藏老化前后的豬皮膠、全蛋、蛋清、蛋黃、牛奶膠樣，加入2.5 mol/L氨水溶液2 mL，超聲萃取1.5 h，5000 r/min離心5 min，吸取上清液，以排除土壤中無機鹽、顏料等的干擾[13，16]。上述操作重復(fù)兩遍，將上清液烘干，備用。

2.3測試方法及條件

2.3.1形貌觀察取3×3 mm蛋白膠樣放在粘有導(dǎo)電膠的樣品座上，噴金后置于掃描電子顯微鏡樣品倉中，抽真空后觀察蛋白膠樣的顯微形貌。測試條件：電壓20 kV，工作距離15 mm，使用二次電子探頭。

2.3.2XRD測試取3～5 mg蛋白膠樣，研磨至粉末后平鋪于單晶硅載物片上并壓平，置于X射線衍射儀試樣倉中進行測試。測試條件：銅靶，管電壓40 kV，管電流150 mA，寬度0.02°，掃描速度15°/min。

2.3.3FTIR測試取3～5 mg蛋白膠樣與200 mg KBr粉末混合，研磨至均勻粉末后，用壓片機于10 MPa下壓制窗片進行FTIR分析。測試條件，掃描次數(shù)：64次，波數(shù)范圍：4000～675 cm，譜帶增強因子取3），使用SavitzkyGolay函數(shù)對光譜求二階導(dǎo)。對得到的子峰峰位進行二級結(jié)構(gòu)指認(rèn)，在Origin 8.5中對譜圖各子峰進行多次高斯曲線擬合，使殘差最小，根據(jù)各子峰面積，計算各二級結(jié)構(gòu)組分的百分含量。

3結(jié)果與討論

3.1蛋白膠樣土壤埋藏老化方法的選擇

我國幅員遼闊，地下埋藏環(huán)境雖受地理位置、水文條件等影響而有所差異，但多數(shù)考古遺址和遺物均深埋于地下，如秦始皇兵馬俑彩繪陶人和陶馬位于地下5 m以下，該層屬于底土層（距地表>50～60 cm），土體緊實，環(huán)境缺氧、無光、低溫，物質(zhì)代謝極其緩慢，地表氣候很難影響到該層。因此，本研究選擇缺氧、避光、低溫、穩(wěn)定密閉的底土層土壤進行文物蛋白膠樣的老化實驗。

3.2形貌觀察

由SEM結(jié)果（圖1）可知，土壤埋藏老化后，5種膠料微觀形貌均出現(xiàn)不同程度的變化。全蛋、蛋黃和牛奶樣品出現(xiàn)溶蝕、鱗片化及脫落現(xiàn)象，其中，蛋黃和全蛋樣品（圖1C、1D、1G和1H）的整體完整性未遭到破壞，而牛奶樣品（圖1I和1J）出現(xiàn)了碎裂，分散成大小不等的塊體; 蛋清樣品整體結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯斷裂（圖1E和1F）; 豬皮膠樣品（圖1A和1B）老化后結(jié)構(gòu)出現(xiàn)輕微疏松化，但整體形貌變化最小，土壤埋藏老化的樣品穩(wěn)定性最高。

3.3XRD分析

由5種蛋白膠料土壤埋藏老化前后的XRD結(jié)果（圖2）可以獲取其特征峰所對應(yīng)的衍射角（2θ）、峰半高寬度（β）及峰面積（Area），利用Bragg方程、Scherrer公式分別計算晶面間距（d）和晶粒大?。―），其中入射X射線Cu靶波長為0.154 nm，Scherrer常數(shù)取0.89，結(jié)果見表1。

豬皮膠和牛奶樣品經(jīng)1年老化后的衍射角不變，蛋類的衍射角樣品較老化前略有減小，但降幅極低（<1%）。根據(jù)文獻[17]可知，衍射角變化不大，說明土壤埋藏老化未改變蛋白膠的物質(zhì)成分。

由Bragg方程計算所得的晶面間距可知，蛋類（包括全蛋、蛋清和蛋黃）樣品老化后的d值略增（<1%），豬皮膠和牛奶樣品均未變化，說明土壤埋藏老化對5種蛋白膠料的晶面間距無明顯影響。

由Scherrer公式計算所得的晶粒大小可知，老化前后5種膠的D值變化程度較低（<5%），說明土壤埋藏老化并未明顯影響晶體尺寸。

所有膠老化后，吸收峰面積均減小，但減少程度不同，其中牛奶樣品減少最顯著（67%），蛋清和全蛋樣品減少程度居中（23%～43%），蛋黃和豬皮樣品的變化?。ǚ謩e減少9%和2%）。由此可知，豬皮樣品最穩(wěn)定，蛋黃樣品次之，牛奶樣品老化最嚴(yán)重。由文獻[18]可知，峰面積與結(jié)晶度呈正相關(guān)。因此，土壤埋藏老化使蛋白膠料的結(jié)晶度均降低，蛋白質(zhì)的有序性降低。

3.4FTIR分析

由老化前后的FTIR譜圖（圖3）可見，5種蛋白膠在老化后出現(xiàn)1654～1657 cm

5種蛋白膠的α螺旋含量均明顯降低，其中，蛋清樣品降低最顯著（39.06%）。5種蛋白膠的β折疊含量呈增加趨勢，平均增量為5.79%。豬皮膠和蛋黃樣品的反平行β折疊結(jié)構(gòu)、平行β折疊結(jié)構(gòu)含量基本未發(fā)生改變，而其余3種樣品的反平行β折疊含量減少（7.05%～13.96%），平行β折疊含量增加（14.01%～23.89%）。5種蛋白膠的無規(guī)則卷曲含量增加，平均增量為11.93%; β轉(zhuǎn)角含量呈升高趨勢（4.10%～15.97%）。豬皮膠和蛋黃樣品的6種二級結(jié)構(gòu)含量變化整體小于其它樣品，從分子層面說明其土壤埋藏穩(wěn)定性相對較高。

5種蛋白膠的二級結(jié)構(gòu)含量均存在α螺旋含量降低、β折疊和無規(guī)則卷曲含量升高的變化規(guī)律，牛奶樣品的變化尤為顯著，說明所有膠料結(jié)構(gòu)均從有序趨于無序狀態(tài)[25]，與上述XRD有序性降低、酰胺A帶變寬、結(jié)構(gòu)出現(xiàn)解螺旋的結(jié)論相吻合。膠料蛋白的二級結(jié)構(gòu)會出現(xiàn)上述變化是因為富含α螺旋的蛋白質(zhì)存在由α螺旋向β折疊轉(zhuǎn)變的趨勢[26]。Chen等[27]使用統(tǒng)一的勢能模型計算出α螺旋和β折疊的勢能，指出前者的勢能（Symbolm@@7.1ε）高于后者（Symbolm@@7.4ε），前者可轉(zhuǎn)化為后者。Ding等[28]通過離散分子動力學(xué)算法得出α螺旋、β折疊和無規(guī)則卷曲的熵值（α螺旋<β折疊<無規(guī)則卷曲）。由熱力學(xué)第二定律可知：在自然過程中，一個孤立系統(tǒng)的總混亂度（熵）會增大（熵增原理）。因此，土壤埋藏老化后，膠料呈現(xiàn)α螺旋含量降低 、β折疊和無規(guī)則卷曲含量增大的趨勢。

3.5不同蛋白膠料土壤埋藏穩(wěn)定性差異的討論綜上，由幾種常見蛋白膠料的顯微形貌、結(jié)晶度、FTIR吸收和二級結(jié)構(gòu)含量變化可知，豬皮膠的土壤埋藏老化穩(wěn)定性高于其它樣品，這取決于其分子組成和結(jié)構(gòu)。

3.5.1分子中疏水性氨基酸含量的影響

本研究組前期研究獲取了豬皮膠、全蛋和牛奶樣品的氨基酸含量分布特征[29]，其中，豬皮膠含疏水性氨基酸丙氨酸（Ala）、甘氨酸（Gly）、纈氨酸（Val）、亮氨酸（Leu）、異亮氨酸（Ile）、脯氨酸（Pro）、苯丙氨酸（Phe）高達73.11%，而全蛋和牛奶樣品含疏水性氨基酸僅52.19%和52.40%。同時相關(guān)研究表明，含疏水性氨基酸[30]高的蛋白質(zhì)，穩(wěn)定性通常更高[31]。因此，從分子中疏水性氨基酸含量影響可知，豬皮膠土壤埋藏的穩(wěn)定性高于蛋類和牛奶樣品。

3.5.2蛋白結(jié)構(gòu)的影響豬皮膠的主要成分膠原蛋白為非常特殊的螺旋結(jié)構(gòu)，具體而言，GlyXY（X和Y 為Gly之外的氨基酸，X 主要是 Pro，Y 主要是羥脯氨酸Hyp）三肽周期結(jié)構(gòu)先組成左手螺旋肽鏈，3條此肽鏈再以右手螺旋方式形成穩(wěn)定的三股螺旋結(jié)構(gòu)[32，33]。豬皮膠這種獨特的結(jié)構(gòu)比含球狀[34]、球狀膠體[35]的蛋類和牛奶樣品的穩(wěn)定性更高。

4結(jié) 論

通過對5種常見彩繪文物蛋白膠料在土壤埋藏老化前后的形貌、結(jié)構(gòu)的對比研究表明，老化膠料表面規(guī)則結(jié)構(gòu)和紋理均遭破壞，整體變得松散化，膠料的衍射角、晶面間距和晶粒大小基本保持不變，結(jié)晶度整體減小。老化膠料雖具有蛋白質(zhì)酰胺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ帶紅外光譜的典型吸收特征，但α螺旋含量降低、β折疊和無規(guī)則卷曲含量增高，說明蛋白結(jié)構(gòu)從有序趨于無序狀態(tài)。在5種膠料中，牛奶的形貌、結(jié)構(gòu)變化相對較大，而豬皮膠相對小，說明后者的土壤埋藏老化穩(wěn)定性優(yōu)于前者。后期可進一步展開老化前后氨基酸一級結(jié)構(gòu)含量的分析，以探討一級結(jié)構(gòu)與二級結(jié)構(gòu)變化之間的關(guān)系，為彩繪文物的劣化機理研究提供科學(xué)依據(jù)。

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