魏海燕，王憲舉，閆 琦，姜翠霞，丁路明，2*，趙索南

(1. 蘭州大學 草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室/生命科學學院，蘭州 730000；2. 青海大學 青海省高寒草地適應性管理重點實驗室，青海 西寧 810016；3. 青海省海北州畜牧獸醫(yī)科學研究所，青海 西海 810299)

近年來通過營養(yǎng)調(diào)控措施達到增強動物的免疫機能和抗病能力，緩解應激引起的生產(chǎn)性能下降，已經(jīng)成為畜牧業(yè)亟需解決的問題[1]。植物活性多糖具有調(diào)節(jié)機體免疫功能、抗菌、抗病毒及抗炎等活性作用[2]。中草藥作為動物飼喂的添加劑既有營養(yǎng)作用，也有藥用作用，可以提高動物生長性能也能保護動物健康[3]。其主要機理是調(diào)動機體的免疫功能和對全身性治療的抗病能力[4]。黃芪含有多糖、黃酮、氨基酸及微量元素和皂苷類等具有抗腫瘤作用的營養(yǎng)成分[5]。黃芪作為臨床所用的一種補益中藥，具有利水退腫、補脾益氣和固表止汗的功能，是一種臨床用于治療肝癌的中藥之一[6]。反芻動物被飼喂抗生素以保持瘤胃發(fā)酵平衡，但飼喂抗生素存在著動物機體內(nèi)的殘余問題以及耐藥性的問題[7],越來越多的植物源添加被用于動物飼料的研究。本試驗通過分別在模擬瘤胃體外發(fā)酵中添加黃芪和四環(huán)素，研究對體外干物質(zhì)消化率、瘤胃發(fā)酵參數(shù)以及瘤胃微生物的影響，為黃芪作為中藥飼料添加劑用于反芻動物飼喂提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及前處理

苜蓿和黃芪采自甘肅省隴西縣；四環(huán)素(注射用鹽酸四環(huán)素)購買于北京賽孚制藥有限公司。本試驗以苜蓿干草粉作為培養(yǎng)底物，苜蓿經(jīng)過65℃烘干后粉碎過1 mm網(wǎng)篩備用。黃芪經(jīng)過65 ℃烘干后，進行切段處理，磨成超細粉(200目)。苜蓿與黃芪的營養(yǎng)成分見表1。

1.2 瘤胃液采集與處理

試驗選取6頭健康的、年齡相近、體重為200±10 kg的牦牛，自由采食，其日糧組分見表2。于08:00晨飼前使用自制瘤胃軟導管分別采集6頭牦牛

表1 底物和添加劑的營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎)

表2 試驗動物飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)水平)

瘤胃液300 mL/頭，經(jīng)4層紗布過濾后一部分分裝入3個10 mL離心管中投入液氮罐帶回實驗室低溫儲存；一部分過濾到39 ℃預熱的保溫瓶中，并混合均勻，迅速運回實驗室。

1.3 試驗設計

準確稱取苜蓿干草粉0.5 g (W1)于濾袋中，并記錄總重(W2)。試驗設置三個處理：在發(fā)酵液中以空白、添加黃芪超細粉、添加抗生素作為三個處理。其中黃芪粉和四環(huán)素的添加量為苜蓿草粉的5%DM。每個處理三個重復。以 Daisy II 培養(yǎng)箱 Daisy PII P Incubator體外模擬培養(yǎng)箱的要求進行緩沖溶液的配制，稱取苜蓿干草粉的濾袋封口后放置于Daisy II培養(yǎng)箱消化罐中 (每個罐放置25個樣品)。將盛有樣品和緩沖溶液的消化罐放置于Daisy II培養(yǎng)箱中，允許消化罐的溫度在20～30 min達到平衡。分別加入400 mL混合均勻的瘤胃液在緩沖溶液和樣品中。分別在體外發(fā)酵12 h、24 h和48h進行發(fā)酵液和濾袋的收集，進行后續(xù)分析。

1.4 樣品分析與檢測

1.4.1 試驗材料的化學成分分析 干物質(zhì)含量采用烘干法進行測定[8]；粗灰分測定參照《飼料分析及飼料質(zhì)量檢測技術》(第三版)[9]；粗蛋白質(zhì)采用凱氏定氮儀(JK-9830，中國)進行測定；中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維采用ANKOM 2000i全自動纖維分析儀進行測定；粗脂肪用乙醚浸提法進行分析[10]。

1.4.2 體外干物質(zhì)降解率 分別取12、24、48 h體外發(fā)酵后的濾袋，在25～39 ℃的溫水中洗滌尼龍袋，用玻璃棒不斷攪拌,不斷換水直至洗滌用水無色為止,在65 ℃烘箱中烘48 h后，回潮稱重。

體外干物質(zhì)降解率(V)： = (W2-W3) / W1

式中：W1:苜蓿干草粉重(g);W2:苜蓿干草粉和濾袋的總重(g):W3:體外發(fā)酵后苜蓿干草粉和濾袋的總重(g)。

1.5 瘤胃液發(fā)酵參數(shù)

1.5.1 瘤胃液pH和揮發(fā)性脂肪酸(VFA) 從Daisy II培養(yǎng)箱取下消化罐，立即進行pH的測定(雷磁PHS-29A)。瘤胃液于4 ℃冰箱解凍，漩渦混勻，取上清液于10 mL離心管中進行離心(2 000 g，10 min),取上清液1 mL置于1.5 mL離心管中，加入0.2 mL去蛋白溶液，混勻，冰水浴中靜置30 min，4 ℃下離心(10 000 g,10 min)，冰水浴儲藏待用。使用微量進樣器進樣，氣象色譜儀(AP-3201A)對瘤胃VFA進行分離，后續(xù)試驗步驟及氣相色譜條件參考周建偉[11]的方法。

1.5.2 瘤胃液氨態(tài)氮NH3-N 取瘤胃液4 mL放入4 ℃ 冰箱中解凍，加入0.3 mL65%(wt/vol)的三氯乙酸，搖勻，之后將樣品放置在冰盒里30 min，隨后將樣品在4 ℃、28 000 g的條件下離心15 min，取上清液用U-2900分光光度計在630 nm波長下測定NH3-N濃度。

1.6 瘤胃微生物的多樣性

將瘤胃液原液以及發(fā)酵過的瘤胃液送于北京百邁克生物科技有限公司進行微生物檢測，主要操作步驟包括：首先對DNA樣品進行提取、PCR擴增和純化；得到優(yōu)化序列；將優(yōu)化序列進行聚類，劃分OTU，并根據(jù)OTU的序列組成得到其物種分類；通過Alpha多樣性分析研究單個樣品內(nèi)部的物種多樣性，統(tǒng)計了各樣品在97%相似度水平下的Chao和Shannon指數(shù)。

1.7 數(shù)據(jù)分析與處理

在Excel中作數(shù)據(jù)的基本處理，應用SPSS 20.0進行ANOVA方差分析和LSD多重比較，數(shù)據(jù)表示為平均值，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結 果

2.1 黃芪粉對模擬瘤胃體外發(fā)酵消化率的影響

由表3知，在發(fā)酵過程中，對照組和黃芪組的消化率極顯著升高，而四環(huán)素組差異不顯著。在12、24、48 h各個時間點，黃芪組顯著高于其他兩組，且在24和48 h對照組顯著高于四環(huán)素組(P<0.05)。

2.2 黃芪粉對模擬瘤胃體外發(fā)酵指標的影響

如表4所示，每個處理組隨著發(fā)酵時間延長pH均下降，其中12～24 h顯著下降。在各個發(fā)酵時間點，四環(huán)素發(fā)酵組的pH均顯著高于其他兩組(P<0.05)。隨著發(fā)酵時間延續(xù)，對照組和四環(huán)素組的NH3-N極顯著上升(P<0.01)；而黃芪組顯著下降(P<0.05)。隨著發(fā)酵時間延續(xù)，對照組和黃芪添加組總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)均極顯著上升(P<0.01)，而四環(huán)素組顯著下降(P<0.05)；在體外發(fā)酵的各個時間點，黃芪組TVFA顯著高于其他兩組，且對照組顯著高于四環(huán)素組(P<0.05)。隨著發(fā)酵時間延續(xù)，對照組和四環(huán)素組乙酸和丙酸在24～48 h極顯著下降(P<0.01)，而黃芪組顯著上升(P<0.05)。隨著發(fā)酵時間延續(xù)，各處理組乙酸/丙酸含量顯著下降(P<0.05)；在12和24 h，對照組和黃芪組顯著高于四環(huán)素組，而對照組和四環(huán)素組差異不顯著；在48 h，黃芪組顯著高于其他兩組，對照組顯著高于四環(huán)素組(P<0.05)。

表3 添加黃芪粉和抗生素在不同模擬瘤胃體外發(fā)酵時間的干物質(zhì)降解率/%

注：同行數(shù)據(jù)肩標不同大寫字母表示差異顯著(P<0.05)，同列數(shù)據(jù)肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

Note: Different lowercase letter superscripts in the same row mean significant difference(P<0.05)，different capital letter superscritps in the same column mean significant difference (P<0.05). The same below.

表4 添加黃芪粉和抗生素對模擬瘤胃體外發(fā)酵液指標的影響

2.3 瘤胃微生物

2.3.1 黃芪粉對體外發(fā)酵瘤胃微生物多樣性的影響 由表5可得，隨著發(fā)酵時間延續(xù)，對照組和四環(huán)素組隨著發(fā)酵時間延續(xù)OTU數(shù)顯著降低，而黃芪組顯著升高；在發(fā)酵12 h，對照組和四環(huán)素組顯著高于黃芪組；在發(fā)酵24和48 h，黃芪組顯著高于其他兩組，且對照組顯著高于四環(huán)素組(P<0.05)。黃芪組隨著發(fā)酵時間延續(xù)，Chao指數(shù)12～48 h呈現(xiàn)出“U”形的變化趨勢；香農(nóng)指數(shù)顯著上升(P<0.05)。對照組和四環(huán)素組隨著發(fā)酵時間延續(xù)，Chao指數(shù)極顯著降低(P<0.01)；香農(nóng)指數(shù)在12～24 h顯著降低(P<0.05)。在發(fā)酵12 h，對照組和黃芪組的Chao指數(shù)顯著高于四環(huán)素組，對照組和四環(huán)素的香農(nóng)指數(shù)組顯著高于黃芪組；在發(fā)酵24和48 h，黃芪組的Chao指數(shù)和香農(nóng)指數(shù)顯著高于其他兩組，且對照組顯著高于四環(huán)素組(P<0.05)。

表5 添加黃芪粉和抗生素對瘤胃微生物OTU數(shù)和Alpha多樣性的影響

2.3.2 黃芪粉對模擬瘤胃體外發(fā)酵瘤胃門水平微生物群落結構的影響 由圖1(左)可見，在門水平上，各組體外發(fā)酵液中的優(yōu)勢菌群均為擬桿菌(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)。由表6可得，擬桿菌(Bacteroidetes)在發(fā)酵各個時間點黃芪組顯著高于其他兩組。厚壁菌門(Firmicutes)在發(fā)酵過程中，對照組和黃芪組顯著升高，而四環(huán)素組顯著下降。變形菌門(Protecbacteria)在發(fā)酵過程中對照組極顯著下降(P<0.01)，且在發(fā)酵的各個時間點，四環(huán)素組顯著高于其他兩組(P<0.05)，且對照組顯著高于四環(huán)素組(P<0.05)。

2.3.3 黃芪粉對體外發(fā)酵瘤胃屬水平的微生物群落結構的影響 由圖1(右)可得，在屬水平上，對照組和黃芪組體外發(fā)酵液的優(yōu)勢菌群為普雷沃氏菌屬_1(Prevotella_1)、腸桿菌屬(Enterobacter)和理研菌科(Rikenellaceae_RC9_gut_group)，四環(huán)素組體外發(fā)酵液的優(yōu)勢菌群為腸桿菌屬(Enterobacter)和埃研氏志賀氏菌(Escherichia-Shigella)。對照組的普雷沃氏菌屬_1(Prevotella_1)在發(fā)酵24 h顯著升高，而黃芪組在發(fā)酵過程中顯著降低。對照組的腸桿菌屬(Enterobacter)在發(fā)酵過程中顯著降低，而四環(huán)素組在發(fā)酵24 h顯著升高(P<0.05)。對照組和黃芪組的理研菌科(Rikenellaceae_RC9_gut_group)在24 h顯著降低(P<0.05)，而四環(huán)素在發(fā)酵過程中極顯著降低(P<0.01)。四環(huán)素組的埃研氏志賀氏菌(Escherichia-Shigella)在發(fā)酵過程中極顯著升高(P<0.01)。

圖1 瘤胃微生物在門(左)和屬(右)水平上的相對豐度

表6 添加黃芪粉和抗生素對于優(yōu)勢瘤胃細菌相對豐度的影響(門水平)

3 討 論

3.1 黃芪粉對模擬瘤胃體外干物質(zhì)降解率的影響

飼料降解率是對飼料利用效率的一個重要衡量，Deng等[12]在用體外發(fā)酵法研究不同濃度的黃芪根部提取物對體外干物質(zhì)降解率的影響研究中發(fā)現(xiàn)，黃芪根部提取物的添加，使得體外發(fā)酵的干物質(zhì)降解率顯著升高。在本試驗中，黃芪組的體外消化率在各個時間段均高于對照組和四環(huán)素組，本試驗與其研究結果一致，其原因可能是黃芪作為一種中草藥所含的活性物質(zhì)有利于飼料的降解。

3.2 不同處理對瘤胃體外發(fā)酵指標的影響

正常的反芻動物瘤胃液pH維持在6～7之間，本試驗中pH的變化范圍在6.33～6.61之間，屬于正常范圍，說明黃芪和四環(huán)素的添加未對瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生不良的影響，隨著發(fā)酵時間延續(xù)，瘤胃液pH處于下降趨勢。這是由于在體外發(fā)酵中，持續(xù)產(chǎn)生的VFA會在發(fā)酵罐中積累，所以使得在試驗結束時pH降低[13]。

瘤胃液NH3-N是對瘤胃液氮代謝的重要衡量標準，其濃度高低可反應飼料蛋白的降解和微生物蛋白的合成情況[14]。本試驗中，對照組和四環(huán)素組NH3-N隨著發(fā)酵時間的延續(xù)逐漸升高，但黃芪組逐漸降低，黃芪組比其他兩組多添加了黃芪，隨著發(fā)酵，微生物蛋白含量升高，使得黃芪組的NH3-N在12 h高于其他組，且隨著發(fā)酵NH3-N濃度降低，這就說明黃芪組的微生物蛋白合成速度大于飼料蛋白降解的速度。但四環(huán)素組NH3-N含量逐漸升高，可能表示著四環(huán)素組微生物蛋白合成速度大于對照組，也可能是由于四環(huán)素組抑制了飼料蛋白的降解。

表7 隨著體外發(fā)酵時間的延續(xù)添加黃芪粉和抗生素在屬水平上優(yōu)勢瘤胃微生物數(shù)量的變化

瘤胃液中的VFA是有機體在發(fā)酵過程中的重要產(chǎn)物，為反芻動物維持正常的新陳代謝提供了能源物質(zhì)[15]。隨著發(fā)酵時間延續(xù)，對照組和黃芪組的TVFA顯著升高，而四環(huán)素組差異不顯著，但呈上升趨勢。且在各個時間點黃芪組高于對照組，說明黃芪組的發(fā)酵罐中最為活躍，能為反芻動物育肥提供豐富的脂肪合成底物。本試驗對照組和黃芪組其中12～24 h增長比24～48 h增長快，這與瘤胃微生物活性有關，微生物在指數(shù)型生長之后，生長速度趨于平緩，然后進入衰退期[16]。本試驗結果說明，黃芪組在體外發(fā)酵中產(chǎn)生了正組合效應，有利于微生物對飼料的降解[15]，且分解速度快，發(fā)酵迅速，使得乙酸和丙酸含量提高。有研究表明，在VFA中丙酸含量上升，說明瘤胃在消化后能量的利用率提高，黃芪組的乙酸/丙酸大于3，此組的發(fā)酵模式屬于乙酸型[15]。因此黃芪組更有利于VFA的生成。

3.3 瘤胃微生物

瘤胃微生物通過一系列復雜的生化反應，把飼料所含有的營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性脂肪酸以及微生物蛋白，從而為反芻動物提供能源[17]。微生物的多樣性研究主要基于編碼核糖體RNA核酸序列保守區(qū)進行的[18]。細菌主要基于16S區(qū)。OTU是認為設計的一個分類單元，其中每一個OTU代表一種序列。Chao指數(shù)是衡量物種豐富度即物種數(shù)量的多少；Shannon指數(shù)用于衡量物種多樣性[19]。在本試驗中，隨著發(fā)酵時間延續(xù)，黃芪組OTU數(shù)顯著增高，而對照組和四環(huán)素組顯著降低，且黃芪組的OTU數(shù)顯著高于其他兩組。隨著發(fā)酵時間延續(xù)，對照組和四環(huán)素組的Chao指數(shù)和Shannon指數(shù)顯著降低，且黃芪組的Chao指數(shù)顯著高于對照組和四環(huán)素組；黃芪組的Shannon指數(shù)顯著高于其他兩組。說明黃芪的添加顯著提高了瘤胃細菌的多樣性，而四環(huán)素組顯著抑制了瘤胃細菌的生長與繁殖。

在瘤胃細菌群落中，擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門是3大優(yōu)勢菌群[20]。李燁青等[16]基于16S-rRNA分析了奶牛體外發(fā)酵瘤胃微生物區(qū)系變化的研究表明擬桿菌的相對豐度會在12 h后降低，而厚壁菌在12 h時升高，這與本試驗的黃芪組的研究結果一致。本試驗中，黃芪組的擬桿菌門顯著降低、厚壁菌門顯著升高，而對照組組兩者都降低，四環(huán)素組兩者都升高，說明黃芪的添加有助于牦牛對于能量的攝取、轉(zhuǎn)化和儲存，而四環(huán)素組抑制了厚壁菌的生長。很大一部分變形菌門的菌屬可以與其它菌屬競爭生存，同時也能在低碳條件下適度生存[21]，所以隨著發(fā)酵時間的延續(xù)，蛋白質(zhì)和淀粉等物質(zhì)基本被降解，變形菌的相對豐度也會相對增加，這與本試驗的四環(huán)素組的研究結果是一致的。普雷沃氏菌屬于擬桿菌門，其可以在瘤胃內(nèi)降解并利用淀粉和植物細胞壁多糖，但是不可以降解纖維素[22]。Li[23]認為普雷沃氏菌屬在降解纖維方面發(fā)揮著潛在作用，其會受到活性比較高的纖維分解菌的抑制，這也就意味著普雷沃氏菌屬的相對豐度隨著發(fā)酵時間延續(xù)而先升高后降低。而在本試驗中，CK組與這個研究結果一致，而黃芪組和四環(huán)素組顯著降低，且四環(huán)素組在各個體外發(fā)酵時間段低于其他兩組，這可能是由于四環(huán)素組抑制了普雷沃氏菌。

腸桿菌屬主要用于發(fā)酵葡萄糖。在本試驗中對照組的該菌屬顯著降低，而黃芪組的該菌屬含量很少，而四環(huán)素組其菌屬顯著升高，說明黃芪的添加抑制了該菌的生長，而四環(huán)素組卻與黃芪組相反。說明四環(huán)素的添加可能有利于該菌屬的生長。Rikenellaceae_RC9_gut_group屬于理研菌科，主要作用是碳水化合物和蛋白質(zhì)的發(fā)酵[24]。在本試驗中對照組其先下降后上升，黃芪組先下降后趨于平穩(wěn)，而四環(huán)素組顯著下降。說明四環(huán)素的添加顯著降低Rikenellaceae_RC9_gut_group的活性。埃希氏志賀氏菌屬于變形菌門屬，對照組和黃芪組的埃希氏志賀氏菌相對豐度很少；但四環(huán)素組隨著發(fā)酵時間延續(xù)，到24 h其相對豐度顯著升高，并且與變形菌的變化趨勢相一致，說明在變形菌門中埃希氏志賀氏菌起著很大的作用。

4 結 論

(1)在瘤胃體外發(fā)酵液中添加黃芪超細粉，提高了體外干物質(zhì)降解率；(2)在瘤胃體外發(fā)酵液中添加黃芪超細粉，增加了總揮發(fā)性脂肪酸濃度、乙酸與丙酸的比；(3)在瘤胃體外發(fā)酵液中添加黃芪超細粉，提高了微生物的相對豐度和多樣性，在門水平上優(yōu)勢菌群為擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門；屬水平上的優(yōu)勢菌群為普雷沃氏菌屬和Rikenellaceae_RC9_gut_group。且黃芪超細粉的添加提高了發(fā)酵罐中厚壁菌門的豐度，降低了擬桿菌門的豐度。