古冬金,蘇小康,王 帥,鄭賢美,李黎明

(東北大學(xué)生命科學(xué)與健康學(xué)院生物技術(shù)研究所,沈陽(yáng) 110819;*通訊作者,E-mail:liming-li2000@163.com)

腦動(dòng)靜脈畸形(brain arteriovenous malformation,BAVM)是一種動(dòng)脈與靜脈之間不經(jīng)過(guò)毛細(xì)血管而直接相連產(chǎn)生的血管畸形[1]。其臨床癥狀為疼痛、出血、靜脈高壓或缺血,但也可能沒(méi)有臨床表現(xiàn)[2]。流體切應(yīng)力是通過(guò)血液流動(dòng)在血管壁上產(chǎn)生的摩擦力,對(duì)血管的發(fā)育有著重要的作用。管腔內(nèi)的循環(huán)血液和管壁內(nèi)層的內(nèi)皮細(xì)胞單層不斷受到由血液流動(dòng)引起的切應(yīng)力[3]。這種機(jī)械刺激引起各種細(xì)胞反應(yīng),包括決定細(xì)胞活性的基因表達(dá)變化和蛋白質(zhì)改變[4]。BAVM病灶的不斷發(fā)展與其畸形血管中異常的血流動(dòng)力學(xué)環(huán)境有關(guān)[5]。Notch信號(hào)通路包括Notch受體(Notch1-4)、Notch配體(Delta-like 1, 3, 4和Jagged1, 2)以及下游基因(Hes和Hey)。Notch信號(hào)通路表達(dá)異常可導(dǎo)致BAVM發(fā)生,有研究表明在人BAVM病變組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表達(dá)明顯升高,并且抑制VEGF傳導(dǎo)可以延緩BAVM形成。此外,也有研究表明切應(yīng)力的作用可以激活內(nèi)皮細(xì)胞Notch通路,切應(yīng)力通過(guò)調(diào)控Notch通路來(lái)調(diào)節(jié)動(dòng)靜脈分化過(guò)程[6]。因此,我們推測(cè)血管微環(huán)境的變化可以影響血管的新生發(fā)育,切應(yīng)力可以激活VEGF,進(jìn)而上調(diào)Notch信號(hào)通路。

本研究選取腦血管內(nèi)皮細(xì)胞(brain microvascular endothelial cells,MECs)為研究對(duì)象,利用平行平板流動(dòng)腔,通過(guò)改變切應(yīng)力作用大小和作用時(shí)間,探究切應(yīng)力對(duì)Notch 通路的影響,進(jìn)而分析切應(yīng)力與Notch 信號(hào)通路在BAVM的發(fā)展過(guò)程中所起的作用,為BAVM 致病機(jī)制及治療手段的進(jìn)一步研究提供思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和試劑

本實(shí)驗(yàn)采用的MEC細(xì)胞系,購(gòu)自北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司;平行平板流動(dòng)腔,購(gòu)自上海泉眾機(jī)電科技有限公司。DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone公司),胎牛血清(美國(guó)Invitrogen公司),胰蛋白酶(美國(guó)Gibco公司),Notch1 抗體(Abcam公司,美國(guó)),Hes1抗體(Abclonal公司,美國(guó)),VEGF抗體(Abclonal公司,美國(guó)),Dll4抗體(Abclonal公司,美國(guó)),GAPDH抗體(Abclonal公司,美國(guó))。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

血管MEC細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)、添加10%標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清、1%的青鏈霉素,置于37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 流體切應(yīng)力加載

平行平板流動(dòng)腔系統(tǒng)用于流體切應(yīng)力加載。該系統(tǒng)包括蠕動(dòng)泵、儲(chǔ)液瓶、管道及流室。流室流道高度0.03 cm、細(xì)胞沿中軸方向種植于7.5 cm×2.4 cm×0.01 cm(長(zhǎng)×寬×高)、經(jīng)過(guò)0.1 g/L多聚賴氨酸包被的玻璃載玻片上。通過(guò)此裝置,細(xì)胞可接受到穩(wěn)定的層切應(yīng)力刺激。采用τ=6μQ/WH2計(jì)算切應(yīng)力強(qiáng)度。其中μ為培養(yǎng)基表觀黏度,Q為流量,W為流槽寬度,H為流槽高度。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)調(diào)節(jié)恒流泵轉(zhuǎn)速改變Q值,達(dá)到實(shí)驗(yàn)所需切應(yīng)力大小。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組

本實(shí)驗(yàn)切應(yīng)力大小為5,10,15 dyn/cm2層流切應(yīng)力,加載時(shí)間為3,6,12 h。實(shí)驗(yàn)分靜止對(duì)照組(0 dyn/cm2組)和切應(yīng)力5 dyn/cm2組、10 dyn/cm2組和15 dyn/cm2組,各組分別在作用3,6,12 h后檢測(cè)蛋白表達(dá)。

1.5 Western blot檢測(cè)VEGF、Notch1、Dll4和Hes1的表達(dá)

將蠕動(dòng)泵中載玻片置于干凈培養(yǎng)皿中,提取蛋白,采用BCA 法測(cè)定蛋白濃度。樣品中加入上樣緩沖液煮沸10 min,然后行SDS-PAGE電泳,濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜90 min,于室溫下5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂牛奶中封閉1 h,將膜置入一抗(VEGF 1 ∶1 000,Notch1 1 ∶1 000, Dll4 1 ∶1 000,Hes1 1 ∶1 000,GAPDH 1 ∶1 000),于4 ℃孵育過(guò)夜,經(jīng)PBST 清洗3 次,于室溫下HRP標(biāo)記的二抗中孵育1 h,經(jīng)PBST 清洗3次后,加入ECL化學(xué)發(fā)光液顯色,于化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)檢測(cè)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 切應(yīng)力作用3 h對(duì)Notch通路的影響

對(duì)MEC施加5,10,15 dyn/cm2層流切應(yīng)力處理3 h后提取細(xì)胞蛋白,通過(guò)Western blot檢測(cè)Notch 通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示VEGF、Notch1、Dll4 和Hes1蛋白表達(dá)量在切應(yīng)力大小為10 dyn/cm2時(shí)最高(P<0.05,見(jiàn)圖1)。

2.2 切應(yīng)力作用6 h對(duì)Notch通路的影響

對(duì)MEC經(jīng)5,10,15 dyn/cm2切應(yīng)力處理6 h后,通過(guò)Western blot檢測(cè)VEGF和Notch通路相關(guān)蛋白的表達(dá),結(jié)果顯示VEGF、Notch1、Dll4 和Hes1在切應(yīng)力強(qiáng)度為15 dyn/cm2時(shí)表達(dá)量最高(P<0.05,見(jiàn)圖2)。

2.3 切應(yīng)力作用12 h對(duì)Notch通路的影響

在MEC 經(jīng)5,10,15 dyn/cm2切應(yīng)力處理12 h后提取細(xì)胞蛋白,通過(guò)Western blot檢測(cè)Notch通路相關(guān)蛋白的表達(dá),結(jié)果顯示VEGF、Notch1、Dll4 和Hes1的表達(dá)量最高時(shí)為切應(yīng)力大小為15 dyn/cm2時(shí)(P<0.05,見(jiàn)圖3)。

與靜止對(duì)照組(0 dyn/cm2)比較,*P<0.05圖1 切應(yīng)力作用3 h后對(duì)Notch通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Figure 1 Effect of shear stress on the expression of Notch signaling pathway-related proteins after MECs being cultured for 3 h

與靜止對(duì)照組(0 dyn/cm2)比較,*P<0.05圖2 切應(yīng)力作用6 h后對(duì)Notch通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Figure 2 Effect of shear stress on the expression of Notch signaling pathway-related proteins after MECs being cultured for 6 h

與靜止對(duì)照組(0 dyn/cm2)比較,*P<0.05圖3 切應(yīng)力作用12 h后對(duì)Notch通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Figure 3 Effect of shear stress on the expression of Notch signaling pathway-related proteins after MECs being cultured for 12 h

3 討論

近年來(lái)有關(guān)生物組織應(yīng)力-生長(zhǎng)關(guān)系研究表明,從器官、組織到細(xì)胞、亞細(xì)胞等各個(gè)層次上的生命運(yùn)動(dòng)都需要一定力學(xué)環(huán)境作為基礎(chǔ)。細(xì)胞與組織的結(jié)構(gòu)、活動(dòng)及其功能與其所處的力學(xué)環(huán)境密切相關(guān)。腦血管內(nèi)皮細(xì)胞與血流直接接觸,血流對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用除了供應(yīng)營(yíng)養(yǎng)外,其作為流體對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞也有著多種機(jī)械力作用,而在這其中,作為血管內(nèi)皮細(xì)胞所處力學(xué)環(huán)境的一個(gè)重要組成部分,切應(yīng)力的作用至關(guān)重要。

研究發(fā)現(xiàn)切應(yīng)力作用可激活血管內(nèi)皮細(xì)胞Notch信號(hào)通路,在切應(yīng)力環(huán)境中培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞30 min后即可在其細(xì)胞核檢測(cè)到NICD段[7],表明切應(yīng)力作用下細(xì)胞Notch 通路被激活。

在BAVM的畸形血管中常存在異常升高的血流切應(yīng)力作用。我們通過(guò)改變切應(yīng)力的作用大小和作用時(shí)間,觀察切應(yīng)力對(duì)Notch通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明,切應(yīng)力可以顯著上調(diào) Notch通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。本次實(shí)驗(yàn)中,在切應(yīng)力作用下,VEGF的表達(dá)上升,且在切應(yīng)力作用時(shí)間相對(duì)較短(≤3 h),切應(yīng)力大小為10 dyn/cm2時(shí)達(dá)到最大,而后隨著作用時(shí)間(≥6 h)的延長(zhǎng),VEGF的表達(dá)量隨著作用力強(qiáng)度的增加而增加。有研究發(fā)現(xiàn)相較于血流正常的低切應(yīng)力血管,在高血流切應(yīng)力血管中,血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF表達(dá)量顯著增高[8]。這與本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果相一致,隨著切應(yīng)力作用時(shí)間的延長(zhǎng),在10 dyn/cm2和15 dyn/cm2作用強(qiáng)度下,VEGF表達(dá)量顯著增高。同樣,隨著切應(yīng)力作用時(shí)間的延長(zhǎng)(≥6 h),作用強(qiáng)度的增加(≥10 dyn/cm2),Notch1蛋白的表達(dá)量較對(duì)照組也顯著增高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,10 dyn/cm2以上切應(yīng)力的作用會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞中Notch1 蛋白表達(dá)量顯著增加,且這種作用是呈切應(yīng)力劑量依賴性。這說(shuō)明切應(yīng)力作用對(duì)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞Notch1 蛋白表達(dá)有促進(jìn)作用,在長(zhǎng)時(shí)間的高切應(yīng)力作用下,腦血管內(nèi)皮細(xì)胞Notch1蛋白表達(dá)量增加,血管內(nèi)皮Notch 通路變得更易被活化,這可能是造成BAVM畸形血管中靜脈發(fā)生動(dòng)脈化的原因之一。

Dll4是Notch蛋白的配體,有研究發(fā)現(xiàn)在BAVM畸形血管內(nèi)皮細(xì)胞中Notch 配體表達(dá)量顯著高于正常組織[9]。本次實(shí)驗(yàn)中,Notch蛋白的配體Dll4蛋白隨著切應(yīng)力強(qiáng)度和作用時(shí)間的增加而表達(dá)量增加,說(shuō)明高切應(yīng)力作用可能會(huì)通過(guò)提高血管內(nèi)皮細(xì)胞表面Notch配體數(shù)量,來(lái)激活其Notch信號(hào)通路。Notch蛋白發(fā)生剪切后,Notch胞內(nèi)段(Notch intracellular domain,NICD)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞核后組裝形成轉(zhuǎn)錄激活物,進(jìn)而激活Hes1的轉(zhuǎn)錄,起始Notch通路下游基因的表達(dá)[10]。而此次實(shí)驗(yàn)中Hes1蛋白的表達(dá)水平隨著切應(yīng)力和作用時(shí)間的增加而增高,一定程度上也反映了Notch通路的激活情況。

總之,BAVM由于動(dòng)靜脈短路而產(chǎn)生高血流切應(yīng)力,同時(shí),短路動(dòng)靜脈畸形中高血流帶來(lái)高靜脈壓,其中靜脈部分不斷擴(kuò)張并發(fā)生纖維化,一方面增加血管破裂風(fēng)險(xiǎn),另一方面又進(jìn)一步降低了血管中的阻力,形成負(fù)反饋過(guò)程不斷加重畸形血管中的高血流狀態(tài)。而切應(yīng)力作用后Notch1蛋白被激活。同時(shí),細(xì)胞在切應(yīng)力作用下培養(yǎng)一段時(shí)間后,其Notch1、Dll4以及Hes1蛋白的表達(dá)量均相對(duì)于靜止培養(yǎng)時(shí)(對(duì)照組)的表達(dá)量明顯上調(diào)。血管內(nèi)皮細(xì)胞受到持續(xù)高切應(yīng)力刺激上調(diào)VEGF,誘導(dǎo)Notch1與Dll4表達(dá)上調(diào),Dll4激活相鄰細(xì)胞的Notch通路,導(dǎo)致BAVM不斷發(fā)展并產(chǎn)生畸形的動(dòng)脈化靜脈血管。因此,我們的研究結(jié)果為預(yù)防和治療腦動(dòng)靜脈畸形提供了新的目標(biāo)和思路。