劉褚雯，易 燦，劉進(jìn)兵

(邵陽(yáng)學(xué)院 食品與化學(xué)工程學(xué)院，湖南 邵陽(yáng) 422000)

酪氨酸酶(EC 1.14.18.1,Tyrosinase)是一種含有銅離子的多酚氧化酶，廣泛分布于自然界中[1-2]。由于其具有獨(dú)特的雙重催化作用，是人體內(nèi)黑色素形成的關(guān)鍵酶，黑色素的過(guò)度合成及分泌會(huì)導(dǎo)致多重疾病的產(chǎn)生，如人體皮膚色素障礙性疾病、帕金森等[3-4]。另外在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，大量的蔬菜和水果由于黑色素分泌過(guò)多而褐變被丟棄[5-6]。而目前已經(jīng)上市的酪氨酸酶抑制劑如曲酸、熊果苷、氫琨等存在較大的副作用，已無(wú)法完全滿足當(dāng)前的需求, 需要進(jìn)一步開(kāi)發(fā)高效低毒的藥物來(lái)滿足社會(huì)的需要[7-11]。

苯并咪唑類化合物是一類具有多種生物活性且結(jié)構(gòu)比較簡(jiǎn)單的氮雜環(huán)類化合物，被廣泛用于農(nóng)藥、醫(yī)藥等領(lǐng)域[12-16]。另外本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)席夫堿類化合物具有很好的酪氨酸酶抑制活性[17-18]，因此依據(jù)生物活性疊加原理，我們?cè)O(shè)計(jì)了該系列化合物(圖1), 將5-氨基苯并咪唑酮與醛兩部分拼合，以期發(fā)現(xiàn)高效低毒的酪氨酸酶抑制劑及抗腫瘤藥物。

圖1 苯并咪唑酮類衍生物的合成

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

WPX-4顯微熔點(diǎn)儀；UV -1780紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)；Bruker Ascend(400M)型核磁共振儀(CDCl3為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo))；美國(guó) Biotek 公司酶標(biāo)儀。

醛、5-氨基苯并咪唑酮和冰乙酸均購(gòu)置于上海達(dá)瑞試劑有限公司，酪氨酸酶購(gòu)置于Sigma-Aldrich公司；A549人肺癌細(xì)胞、HepG2人肝癌細(xì)胞及MCF-7人乳腺癌細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫(kù)；RPMI-1640 培養(yǎng)基(Thermo公司)；胎牛血清(Hy-clone公司)；CCK-8試劑及二甲基亞砜(Amresco公司)；其他試劑均為市售分析純，未進(jìn)一步純化處理。

1.2 2a～2h的合成通法[17]

將(10 mmol)5-氨基苯并咪唑酮和12 mmol 1a～1h分別加入到圓底燒瓶中，再加入20 mL無(wú)水乙醇，攪拌下緩慢滴加3滴冰乙酸，升溫至回流狀態(tài)后保溫反應(yīng)，TLC跟蹤反應(yīng)。待反應(yīng)完成，冷卻至室溫后置于冰箱中靜置，析出大量固體，抽濾，冷的乙醇洗滌，粗產(chǎn)品經(jīng)95%乙醇重結(jié)晶，晾干得中間產(chǎn)物2a～2h。

2a：黃色固體，收率90.2%；1HNMR(DMSO-d6，300 MHz)，δ13.73(s，1H，-OH)，δ10.73(s，1H，-NH)，δ10.0(s，1H，-NH)，δ10.15(s，1H，-OH)，8.75(s，1H，=CH)，7.39～7.37(d，J = 8.3Hz，1H，Ph-H)，6.94～6.93(d，J = 5.7 Hz，3H，Ph-H)，6.37～6.25(m，2H，Ph-H)；13CNMR(DMSO-d6，75 MHz)，δ 163.3，162.4，160.8，156.1，141.9，134.5，131.0，129.0，114.9，112.6，109.3，108.1，102.8，101.2。

2b：淡黃色固體，收率91.2%；1HNMR(DMSO-d6，300 MHz)，δ13.73(s，1H，-OH)，δ10.62(s，2H，-NH)，8.84(s，1H，=CH)，7.97(s，1H，Ph-H)，7.49～7.45(m，1H，Ph-H)，7.14～7.11(m，1H，Ph-H)，7.01(s，1H，Ph-H)，6.92～6.83(m，3H，Ph-H)，3.87(s，3H，-OCH3)；13CNMR(DMSO-d6，75 MHz)，δ 159.5，156.0，153.4，145.8，133.1，130.9，127.0，124.6，121.0，114.9，112.3，109.2，101.4，56.2。

2c：黃色固體，收率92%；1HNMR(DMSO-d6，300 MHz)，δ13.73 (s，1H，-OH)，δ10.58 (s，2H，-NH)，8.71(s，1H，=CH)，7.94～7.91(d，J = 8.5 Hz,1H，Ph-H)，6.90～6.88(d，J = 8.1 Hz，1H，Ph-H)，6.82～6.77(m，2H，Ph-H)，6.64～6.61(m，2H，Ph-H)，3.86(s，3H，-OCH3)，3.85(s，3H，-OCH3)；13CNMR (DMSO-d6，75 MHz)，δ 163.6，160.8，155.9，152.8，146.1，130.7，128.3，117.6，114.5，109.0，106.7，101.2，98.4，56.1，55.8。

2d：淡黃色固體，收率91.1%℃；1HNMR (DMSO-d6，300 MHz)，δ13.73(s，1H，-OH)，δ10.67(s，2H，-NH)，8.75(s，1H，=CH)，8.08～8.05(m，1H，Ph-H)，7.75～7.52(m，1H，Ph-H)，7.34～7.29(m，2H，Ph-H)，6.998～6.92(m，3H，Ph-H)；13CNMR(DMSO-d6，75 MHz)，δ 163.5，161.0，155.9，150.6，144.8，133.3，130.7，127.8，125.1，124.0，116.5，115.2，109.0，101.5。

2e：棕色固體，收率40.2%；1H NMR (DMSO-d6，300 MHz)，δ 10.72(s，1H)，10.68(s，1H)，8.64(s，1H)，7.99～7.84(m，2H)，7.58～7.45(m，3H)，6.98～6.85(m，3H)；13C NMR(DMSO-d6，500 MHz)，δ 158.67，156.27，145.32，137.05，131.66，131.10，129.43，129.23，129.07，115.39，109.34，101.80。

2f：橙色固體，收率70.2%；1H NMR (DMSO-d6，300 MHz)，δ 13.56(bs，1H)，10.80(bs，2H)，8.95(s，1H)，7.21(d，1H，J=7.5 Hz)，7.12～6.84(m，5H)，3.81(s，3H)；13C NMR(DMSO-d6，500 MHz)，δ 161.69，156.27，151.15，148.57，141.68，131.30，129.92，124.49，120.06，119.12,116.91，115.71，109.50，101.67，56.59.。

2g：黃色固體，收率80.2%；1H NMR (DMSO-d6，300 MHz)，δ 14.59(s，1H)，10.83(bs，2H)，9.07(s，1H)，7.14～7.22(m，2H)，7.10～7.07(m，2H)，7.12～6.96(m，2H)；13C NMR(DMSO-d6，500 MHz)，δ 163.01，160.03，156.19，140.84，134.63，131.41，130.53，126.16，124.10，117.80，117.48，116.00，109.68，101.67。

2h：黃色固體，收率82.2%；1H NMR ((DMSO-d6，300 MHz)，δ 13.84(s，1H)，11.27(s，1H)，11.21(s，1H)，9.36(s，1H)，8.27(s，1H)，7.93(d，1H，J=8.7 Hz)，7.39(d，1H，J=8.7 Hz)，7.51～7.32 (m，3H)；13C NMR(DMSO-d6，500 MHz)，δ 159.95，156.27，141.50，135.56，134.57，131.30，130.21，122.02，119.62，116.17，110.44，109.51，101.55，31.39。

1.3 抑制酪氨酸活性測(cè)試

采用本課題組通用的酪氨酸酶抑制活性測(cè)試方法進(jìn)行[17]。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)及增殖情況檢測(cè)[19]

A549細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640( Roswell Park Memorial Institute-1640)完全培養(yǎng)基，37℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

用CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞、HepG2細(xì)胞及MCF-7細(xì)胞，以2×104cell·mL-1的濃度接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁后，在各孔加入不同濃度(1，2，4，8，16，32，64，128，256，512，1024 ng·mL-1)的化合物2a-2j，空白對(duì)照組未加入藥物，陽(yáng)性對(duì)照組加入5-氟尿嘧啶，計(jì)算2a-2j及5-氟尿嘧啶的IC50值。

2 結(jié)果與討論

2.1 合成部分

本文通過(guò)實(shí)驗(yàn)合成了8個(gè)苯并咪唑類類衍生物，其收率在40.2%～92.0%之間。其中無(wú)取代的苯甲醛收率最低，為40.2%。當(dāng)苯甲醛2號(hào)及4號(hào)位上被甲氧基取代時(shí)收率最高，為92.0%。由此初步推測(cè)，苯甲醛上取代基的存在提高了反應(yīng)活性。

2.2 酪氨酸酶抑制活性

參照文獻(xiàn)，檢測(cè)所有化合物對(duì)酪氨酸酶的抑制活性，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 化合物2a～2h對(duì)酪氨酸酶抑制活性

如表1 所示，化合物2a與化合物2f具有一定的酪氨酸酶抑制活性，通過(guò)SPSS Statistics 17.0計(jì)算化合物2a和化合物2f的IC50值分別為(120.25 ± 1.06)μM和(111.17 ± 0.86)μM，與陽(yáng)性對(duì)照藥物熊果苷(IC50值(102.11± 1.12)μM)相當(dāng)，其他化合物的抑制酪氨酸酶活性效果都不如陽(yáng)性對(duì)照藥物熊果苷，說(shuō)明苯環(huán)上羥基取代可能有利于提高抑制活性，甲氧基取代基位置改變或甲氧基數(shù)目增加對(duì)抑制活性不利，這可能與甲氧基的共軛效應(yīng)以及位阻效應(yīng)有關(guān)。

2.3 抗腫瘤活性

表2 化合物2a～2h抗腫瘤活性

分別考察了所合成的8個(gè)化合物對(duì)A549人肺癌細(xì)胞、HepG2 人肝癌細(xì)胞及MCF-7 人乳腺癌細(xì)胞的抑制作用，結(jié)果見(jiàn)表2。從表2可以發(fā)現(xiàn)，所有化合物對(duì)A549人肺癌細(xì)胞和HepG2 人肝癌細(xì)胞均沒(méi)有明顯的抑制作用，除化合物2d外，對(duì)MCF-7 人乳腺癌細(xì)胞也沒(méi)有明顯的抑制作用。

3 結(jié)論

本文合成了8個(gè)苯并咪唑衍生物，并考察了所有目標(biāo)化合物抑制酪氨酸酶活性及抗腫瘤效果。其中化合物2f抑制酪氨酸酶活性效果最好，其IC50值為(111.17 ± 0.86) μM，與陽(yáng)性對(duì)照藥物熊果苷抑制活性相當(dāng)；初步構(gòu)效關(guān)系分析表明，羥基的位置和羥基的數(shù)目對(duì)抑制酪氨酸酶活性效果有一定的影響；另外該系列化合物對(duì)除2d對(duì)MCF-7人乳腺癌細(xì)胞有明顯抑制作用外，其他化合物對(duì)A549人肺癌細(xì)胞、HepG2 人肝癌細(xì)胞及MCF-7 人乳腺癌細(xì)胞均沒(méi)有明顯的抑制作用。這些研究成果為后續(xù)深入開(kāi)展工作提供了重要參考。