侯普馨，侯艷茹，白艷蘋，蘇 琳，趙麗華，寶勒格，靳 燁,*

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.烏拉特中旗農(nóng)牧業(yè)局，內(nèi)蒙古 烏拉特中旗 015300）

亞麻籽又稱胡麻籽，是一種常見的油料作物，含有豐富的油脂和蛋白，其中油脂質(zhì)量分數(shù)高達35%～45%，具有豐富的多不飽和脂肪酸，如α-亞麻酸和亞油酸等。亞麻籽除了含有豐富的油脂外，還含有含量較高的木酚素、維生素以及黃酮類、酚酸類等生物活性成分，具有抗氧化、清除自由基、預防心血管疾病等作用[1-2]。在反芻動物中，由于瘤胃的氫化作用，使得肌肉中含有大量的飽和脂肪酸，不利于肉品質(zhì)的改善，因此亞麻籽可作為優(yōu)質(zhì)的飼料添加劑[3-4]。

肌纖維是組成肌肉組織的基本單位，機體中肌纖維的數(shù)量在其出生時就已穩(wěn)定，但肌纖維類型的組成易受到遺傳、營養(yǎng)和生理等因素的影響而發(fā)生轉變[5]。大量研究表明，肌纖維類型的轉化遵循I?IIa?IIx/d?IIb的路徑，許多動物的肌纖維都具有這樣的雙向轉化潛力[6]。肌纖維的密度、數(shù)量、直徑、橫截面積等都與肉品品質(zhì)密切相關[7]。尤其是當肉品中氧化型肌纖維所占比例較高時，肉品pH值、風味、顏色、大理石紋評分和肌內(nèi)脂肪含量較高，肌肉系水力強、細嫩多汁，肉質(zhì)良好[8]。目前通過改變肌纖維類型組成從而改善肉品質(zhì)已經(jīng)成為肉品科學領域的研究熱點。

在動物生長發(fā)育過程中，營養(yǎng)物質(zhì)通過消化吸收最終轉化為肌肉和脂肪，養(yǎng)分的代謝過程必然涉及機體的能量和蛋白質(zhì)代謝，并最終影響動物肉品質(zhì)[9]。有研究表明，日糧中添加n-3系列多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFA）可以平衡動物體內(nèi)n-3與n-6系列脂肪酸的比例，既促進了n-3 PUFA的吸收也利于人體健康[10-11]。Joo等[12]研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加共軛亞油酸使豬肉肌內(nèi)脂肪含量增加，系水力提高，脂肪酸組成發(fā)生改變。蔡傳江等[13]報道飼料中添加亞麻籽油能夠顯著提高豬背最長肌中α-亞麻酸、二十碳五烯酸和n-3 PUFA的含量。陶文君等[14]通過對育肥豬日糧中添加不同油脂發(fā)現(xiàn)，橄欖油組和亞麻油組中母豬的紅肌纖維、肌間纖維、白肌纖維均顯著高于去勢公豬，且橄欖油組各類型纖維直徑較亞麻油組有所提高。綜上所述，日糧中添加不飽和脂肪酸對肉品質(zhì)、肌纖維特性和脂肪酸組成均有不同程度的影響。因此，通過添加不飽和脂肪酸調(diào)控日糧營養(yǎng)進而影響肌纖維的轉化是改善肉品品質(zhì)的重要途徑。

本實驗分別運用ATPase染色法及肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain，MyHC）基因表達量對肌纖維進行分型，并測定琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase，SDH）和乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LDH）活力和肉品質(zhì)指標，研究日糧中添加亞麻籽對蘇尼特羊背最長肌肌纖維特性及肉品質(zhì)的影響，旨在為改善肉品品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

于內(nèi)蒙古巴彥淖爾市烏拉特中旗川井蘇木鎮(zhèn)選擇3 月齡、體質(zhì)量（16.94±1.29）kg、體況良好的純種蘇尼特羊20 只，隨機分為2 組：亞麻籽組和對照組，每組10 只，公母各半。

亞麻籽 市售；異戊烷 阿法埃莎（天津）化學有限公司；巴比妥鈉 山東西亞化學股份有限公司；醋酸鈉、氯化鈣、氯化鈷 國藥集團化學試劑有限公司；硫化銨 上海麥克林生化科技有限公司；腺苷-5’-三磷酸二鈉鹽 北京酷來搏科技有限公司；三氯甲烷北京化工廠；異丙醇 上海振興化工二廠有限公司；RNAiso Plus、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、TB GreenTMPremix Ex TaqTMII 大連寶生物工程有限公司；SDH、LDH測試盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

胴體肌肉pH值直測儀 德國Matth?us公司；C-LM3B型數(shù)顯式肌肉嫩度儀 東北農(nóng)業(yè)大學工程學院研制；TC-P2A全自動測色色差儀 北京奧依克光電儀器有限公司；MEV冰凍切片機 德國SLEE公司；DM4000B顯微鏡 德國LEICA公司；5417冷凍離心機德國Eppendorf生物公司；Biometra聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增儀 北京北方華奧貿(mào)易有限責任公司；LightCycler?96實時熒光定量PCR儀 羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司；BG-power 3500型穩(wěn)定溫流電泳儀、水平電泳槽 北京百晶生物技術有限公司；凝膠成像分析系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；UV-1800型紫外-可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；Synergy H1多功能微孔板檢測儀 美國伯騰儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗設計

采用完全隨機化設計，以日糧為實驗處理。對照組日糧組成：精飼料10 kg、青貯飼料8 kg和葵花餅5 kg；亞麻籽組日糧：將亞麻籽按照對照組精飼料質(zhì)量分數(shù)8%替代，添加于上述日糧中，混合并攪拌均勻。每月精飼料、青貯飼料、葵花餅分別增加2、8、5 kg。每日飼喂3 次，自由飲水。預實驗期7 d，實驗期3 個月。

1.3.2 肉品質(zhì)指標測定

分組前測量體質(zhì)量，記錄月增體質(zhì)量。羊屠宰45 min后，測定胴體質(zhì)量、背最長肌pH值（pH0）、色差（L*值、a*值、b*值）、嫩度及蒸煮損失。將羊肉放置在排酸庫排酸24 h后再次測定pH值（pH24）。

1.3.3 組織學特性測定

在羊屠宰1 h內(nèi)，取左半胴體背最長肌，將肌肉順肌纖維的方向切成0.5 cm×0.5 cm×1.0 cm大小的肉塊，先放入預冷的異戊烷中脫水干燥約30 s，再放入液氮中速凍，置于-80 ℃的冰箱中保存。將處理好的樣品置于-25 ℃冰凍切片機中切成10 μm厚的橫斷面片。用ATPase（pH 4.6）組織化學染色法[15]進行染色。將染好的切片用Qwin V3纖維彩圖分析軟件分析肌纖維的各項指標（包括肌纖維密度、各類型肌纖維數(shù)量、面積、直徑和橫截面積），肌纖維總數(shù)不少于1 500 根。

1.3.4MyHC基因表達測定

1.3.4.1 RNA提取與反轉錄

在羊屠宰1 h內(nèi)，取左半胴體背最長肌約100 mg裝入無酶無菌凍存管中，放入液氮中冷凍，置于-80 ℃的冰箱中保存，用于總RNA的提取。運用TRIzol法按照RNAiso Plus試劑盒使用說明書提取肌肉中總RNA。將提取的總RNA用質(zhì)量分數(shù)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，用微量分光光度計測定總RNA的濃度和純度。按照反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄合成cDNA。目的基因MyHCI、MyHCIIa、MyHCIIb、MyHCIIx以及管家基因GAPDH引物引用參考文獻[7,16]，引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物信息如表1所示。

表1 實時熒光定量PCR引物Table 1 Primers used for real-time PCR

1.3.4.2 實時熒光定量PCR

以cDNA為模板，按照TB GreenTMPremix ExTaqTMII說明書配制PCR反應液，進行實時熒光定量PCR。用質(zhì)量分數(shù)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測實時熒光定量PCR產(chǎn)物，凝膠成像儀拍照。采用2-ΔΔCt法計算基因相對表達量，ΔΔCt值按下式計算。

1.3.5 SDH和LDH活力測定

SDH和LDH活力均按照測試盒說明書進行測定。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

實驗數(shù)據(jù)使用SPSS 20.0軟件的單因素方差分析和Pearson相關性分析進行差異性比較，結果用平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 日糧中添加亞麻籽對蘇尼特羊背最長肌肌纖維特性的影響

2.1.1 肌纖維ATPase染色結果

圖1 蘇尼特羊背最長肌ATPase染色結果（×100）Fig. 1 ATPase staining of LD in Sunit sheep from two groups (× 100)

根據(jù)肌纖維內(nèi)ATP酶的酸堿穩(wěn)定性差異通過ATPase染色法對肌纖維進行分類，亞麻籽組和對照組蘇尼特羊背最長肌ATPase染色結果如圖1所示。經(jīng)ATPase染色后兩組羊背最長肌肌纖維主要分為3 種類型：I型肌纖維（黑色）、IIA型肌纖維（淺色）和IIB型肌纖維（棕褐色）；其中I型肌纖維為慢速氧化型、IIA型肌纖維為快速氧化-酵解型、IIB型肌纖維為快速酵解型。

2.1.2 日糧中添加亞麻籽對不同類型肌纖維數(shù)量比例和面積比例的影響

圖2 日糧中添加亞麻籽對蘇尼特羊背最長肌肌纖維數(shù)量比例（A）和面積比例（B）的影響Fig. 2 Effect of dietary linseed supplementation on percentage number (A)and area (B) muscle fibers of LD from Sunit sheep

由圖2可知，亞麻籽組和對照組不同類型肌纖維數(shù)量比例無明顯差異，其中亞麻籽組羊背最長肌I型肌纖維數(shù)量比例為9.41%，高于對照組，IIA型、IIB型肌纖維數(shù)量比例接近，低于對照組。亞麻籽組IIA型肌纖維面積比例為39.62%，高于對照組，IIB型肌纖維面積比例為53.78%，低于對照組。任陽[17]研究比較脂肪酸對肌纖維組成的影響發(fā)現(xiàn)，與飽和脂肪酸相比，日糧添加不飽和脂肪酸促進了肌纖維類型由酵解型向氧化型轉化，使氧化型肌纖維比例提高。周錫紅等[18]從蛋白角度研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加不飽和脂肪酸飼喂母豬，其后代仔豬肌肉中慢速氧化型（I型）肌纖維特異蛋白肌鈣蛋白I-SS表達水平較高，氧化型肌纖維比例顯著高于飽和脂肪酸組（P＜0.05）。由此可知，日糧中添加不飽和脂肪酸可以促進肌纖維類型由酵解型向氧化型轉化，本實驗中日糧添加亞麻籽后，蘇尼特羊背最長肌中I型肌纖維比例有提高的趨勢。

2.1.3 日糧中添加亞麻籽對不同類型肌纖維直徑和橫截面積的影響

動物出生后肌纖維總數(shù)量基本不再變化，生長發(fā)育主要是肌纖維直徑與面積的增加。肌纖維直徑受眾多因素的影響，不同品種畜肉隨著體質(zhì)量的增加，肌纖維直徑變大，但幅度有所差異；機體營養(yǎng)水平較低時，肌纖維直徑較小[19-20]。由圖3可知，亞麻籽組蘇尼特羊背最長肌I型和IIB型肌纖維直徑和橫截面積均極顯著小于對照組（P＜0.01），IIA型肌纖維直徑也極顯著小于對照組（P＜0.01），但IIA型肌纖維橫截面積在兩種飼養(yǎng)條件下沒有顯著差異（P＞0.05）。Migdal等[21]研究結果表明，日糧中添加共軛亞油酸可以顯著降低紅?。↖型）纖維數(shù)量和直徑，與本實驗結果相一致。但Emelie等[22]報道，老年女性通過膳食攝入n-3系列不飽和脂肪酸可引起II型肌纖維肥大，緩解肌肉質(zhì)量下降的癥狀。以上研究結果不一致，可能是不飽和脂肪酸的類型、添加量、添加階段和持續(xù)時間不同所致。

圖3 日糧中添加亞麻籽對蘇尼特羊背最長肌肌纖維直徑（A）和橫截面積（B）的影響Fig. 3 Effect of dietary linseed supplementation on muscle fiber diameter (A) and cross-sectional area (B) of LD from Sunit sheep

2.2 日糧中添加亞麻籽對蘇尼特羊背最長肌MyHC基因表達量的影響

圖4 日糧中添加亞麻籽對蘇尼特羊背最長肌MyHC基因mRNA相對表達量的影響Fig. 4 Effect of dietary linseed supplementation on relative expression of MyHC gene in LD from Sunit sheep

通過MyHC的差異表達對肌纖維進行分類的分子分型方式更為準確、可靠。依據(jù)MyHC的多態(tài)性可將肌纖維分為I型（慢速氧化型）、IIa型（快速氧化型）、IIx（或IId型，中間型）、IIb型（快速酵解型）[6]。由圖4可知，亞麻籽組羊背最長肌MyHCI基因和MyHCIIx基因mRNA相對表達量均極顯著高于對照組（P＜0.01），MyHCIIa基因和MyHCIIb基因mRNA相對表達量高于對照組，但差異不顯著（P＞0.05）。與此一致，周錫紅等[18]報道日糧中添加不飽和脂肪酸飼喂母豬，其后代仔豬中MyHCI、MyHCIIa、MyHCIIb、MyHCIIx基因表達量均顯著提高。Wataru等[23]通過研究不同類型膳食油脂對大鼠肌纖維組成和相關代謝基因的影響發(fā)現(xiàn)，日糧添加魚油可以顯著提高MyHCIIx基因表達水平，降低MyHCIIb基因表達水平。

2.3 日糧添加亞麻籽后蘇尼特羊背最長肌肌纖維比例與MyHC基因表達量的相關性

表2 肌纖維數(shù)量和面積比例與MyHC基因mRNA相對表達量的相關性Table 2 Correlation coefficients between relative expression of MyHC gene and muscle fiber type composition

由表2可知，MyHCI和MyHCIIa基因mRNA相對表達量均與I型和IIA型肌纖維數(shù)量比例和面積比例呈正相關。MyHCIIb基因和MyHCIIx基因mRNA相對表達量均與IIB型肌纖維的數(shù)量比例和面積比例呈正相關；說明MyHC基因表達量與ATPase組織化學染色法對肌纖維的分型結果基本一致。

2.4 日糧中添加亞麻籽對蘇尼特羊背最長肌SDH和LDH活力的影響

圖5 日糧中添加亞麻籽對蘇尼特羊背最長肌中SDH和LDH活力的影響Fig. 5 Effect of dietary linseed supplementation on SDH and LDH activity in LD from Sunit sheep

肌肉的代謝類型通常分為氧化代謝和酵解代謝，I型肌纖維主要通過氧化代謝提供能量，II型肌纖維主要通過酵解代謝提供能量，肌肉中的SDH與LDH的活力在一定程度上可以反映肌肉的代謝狀況[24]。SDH是三羧酸循環(huán)所有限速酶中唯一進入線粒體內(nèi)膜的有氧代謝酶，是線粒體的標志性酶，常用于評價肌肉氧化活性[25]。LDH普遍存在于全身各組織細胞中，是機體糖酵解功能系統(tǒng)的關鍵酶之一，其活性可反映細胞內(nèi)無氧酵解的活躍程度[26]。由圖5可知，亞麻籽組羊背最長肌SDH活力極顯著高于對照組（P＜0.01），LDH活力極顯著低于對照組（P＜0.01），這表明日糧中添加亞麻籽可以提高蘇尼特羊背最長肌中SDH活力、降低LDH活力，從而提高肌肉的氧化代謝水平。

2.5 日糧中添加亞麻籽對蘇尼特羊背最長肌肉品質(zhì)的影響及肌纖維特性與部分肉品質(zhì)的相關性分析

表3 日糧中添加亞麻籽對蘇尼特羊背最長肌肉品質(zhì)的影響（n＝10）Table 3 Effect of dietary linseed supplementation on meat quality of LD from Sunit sheep (n = 10)

由表3可知，亞麻籽組羊背最長肌L*值極顯著低于對照組（P＜0.01），亞麻籽組羊屠宰后背最長肌初始pH0值為6.56，顯著高于對照組（P＜0.05），經(jīng)靜置排酸24 h后，對照組羊背最長肌pH24值為5.72，極顯著高于亞麻籽組（P＜0.01）。亞麻籽組羊背最長肌剪切力極顯著小于對照組（P＜0.01）。兩組之間其他肉品質(zhì)指標無顯著差異。Migdal等[21]研究日糧中添加共軛亞油酸對皮特蘭豬肉品質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)日糧中添加質(zhì)量分數(shù)2%的共軛亞油酸不改變豬的肥育效果和屠宰性能，也未對肉的某些性狀和食用品質(zhì)產(chǎn)生影響，與對照組相比，僅肉的風味、L*和b*值存在顯著差異。Nuernberg等[27]研究比較了在日糧中添加橄欖油和亞麻油對生長肥育雜交豬肉品質(zhì)的影響，結果表明，飼喂較高含量的單不飽和脂肪酸/多不飽和脂肪酸的植物油對胴體和肉質(zhì)性狀均沒有顯著影響。

表4 肌纖維特性與部分肉品質(zhì)的相關性Table 4 Correlation coefficients between muscle fiber characteristics and meat quality

肌纖維是肌肉組織的基本組成單位，其類型是決定肉品質(zhì)的一個重要因素。肌纖維的數(shù)量、直徑、橫截面積、不同類型肌纖維的數(shù)量比例以及面積比例都與肉品質(zhì)密切相關[7]。由表4可知，L*值與IIB型肌纖維的比例、直徑、橫截面積呈正相關。IIB型肌纖維屬于白肌，其細胞色素和肌紅蛋白含量較少，外觀呈白色，因此當肌肉中IIB型肌纖維所占比例較高時，肌肉L*會增加[6]。pH值是評定肉質(zhì)的重要指標之一，動物宰后進行糖酵解代謝是其pH值下降的主要原因，而不同類型肌纖維的糖酵解潛力各不相同。本研究結果顯示，亞麻籽組羊背最長肌pH0值顯著高于對照組（P＜0.05），pH24值極顯著低于對照組（P＜0.01）；pH0值與IIA型肌纖維比例呈正相關，與IIB型肌纖維比例呈負相關，pH24值與I型、IIA型肌纖維比例呈正相關，與IIB型肌纖維比例呈負相關。林在瓊[28]的研究同樣得出，宰后24 h巴美肉羊的pH值與IIA型肌纖維比例呈正相關，而與IIB型肌纖維比例呈負相關。亞麻籽組pH0值高于對照組，可能是由于亞麻籽組肌肉中I型肌纖維數(shù)量比例、IIA型肌纖維數(shù)量和面積比例均較對照組高，其中I型肌纖維中線粒體數(shù)目較多且糖原含量較低，糖酵解潛力也較低[29]，所以pH0值較高。在排酸24 h后，對照組pH24值極顯著高于亞麻籽組，這可能是由于酵解型肌纖維中鈣蛋白酶/鈣蛋白酶抑制蛋白的比值較氧化型肌纖維大，因此酵解型肌纖維的成熟速率更快[30]，對照組中II型肌纖維較多，使得pH值回升較快。肌纖維類型可以通過肌纖維直徑差異影響肉的嫩度。劉冰[31]研究得出，肌纖維直徑與剪切力呈正相關，即肌纖維直徑越小，剪切力越小，肌肉越細嫩。Kim等[32]研究發(fā)現(xiàn)IIb型肌纖維直徑與眼肌面積呈正相關，與嫩度呈負相關。郎玉苗[33]研究發(fā)現(xiàn)，肌纖維直徑和面積與剪切力和硬度呈顯著正相關，提高I型肌纖維比例和降低II型肌纖維比例能夠改善牛肉嫩度。本研究結果顯示，亞麻籽組羊背最長肌的剪切力極顯著小于對照組（P＜0.01），即亞麻籽組羊肌肉更加細嫩，3 種類型肌纖維直徑和橫截面積與剪切力呈極顯著正相關（P＜0.01），隨著肌纖維直徑和橫截面積的增大，剪切力隨之增大，嫩度降低；I型肌纖維數(shù)量比例、IIA型肌纖維比例與剪切力呈負相關，IIB型肌纖維比例與剪切力呈正相關。總體而言，日糧添加亞麻籽通過改變肌纖維的直徑，提高氧化型肌纖維比例和降低酵解型肌纖維的比例，對改善肉的嫩度具有積極作用。

3 結 論

本研究結果顯示日糧中添加亞麻籽飼喂蘇尼特羊，對降低羊肉L*值、提高嫩度發(fā)揮著積極作用，肌肉的氧化代謝水平明顯提高，各類型肌纖維的直徑和橫截面積均較小。通過ATPase染色法和根據(jù)MyHC mRNA相對表達量的肌纖維分型結果均表明，日糧添加亞麻籽后，羊背最長肌中I型肌纖維比例有提高的趨勢，提示酵解型肌纖維向氧化型肌纖維轉化。因此，日糧中添加亞麻籽進一步影響了羊肉肌纖維特性，改善肉品品質(zhì)。目前，為適應草原畜牧業(yè)持續(xù)發(fā)展，羊養(yǎng)殖方式由放牧逐漸轉變?yōu)樯犸暎虼送ㄟ^調(diào)控日糧營養(yǎng)改善畜肉品質(zhì)將是未來的研究重點。