張正升，韓貴芝，張丹丹，張 申，林 立，張兆強(qiáng)

缺血性心臟病是由于冠狀動脈循環(huán)改變引起冠狀動脈血流和心肌需求之間不平衡而導(dǎo)致的心肌損害，以冠心病心絞痛和急性心肌梗死最常見[1]。我國每年由突發(fā)性冠心病心絞痛和急性心肌梗死引起的死亡率高達(dá)3.2%。缺血性心臟病在我國的發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢，早期預(yù)防和控制是降低其發(fā)生的重要策略[2]。大蒜素具有降血脂、擴(kuò)張血管、抗血小板聚集、抗動脈粥樣硬化、抗氧化、降血壓、防治心腦血管疾病等作用[3]。近年來，國內(nèi)外大量研究表明，大蒜素作用于缺血性心臟病的多個發(fā)病環(huán)節(jié)，降低冠狀動脈灌注壓和心臟負(fù)荷，通過低壓低速灌注可防治再灌注損傷，對缺血性心臟病心肌具有保護(hù)作用，大蒜素的作用機(jī)制也成了研究的熱點[4-5]。本研究旨在探討大蒜素的心肌保護(hù)作用是否與降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)受體mRNA表達(dá)有關(guān)，尋找大蒜素在心肌內(nèi)的作用靶點，探究大蒜素對心肌缺血保護(hù)的分子生物學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 無特異性病原菌級別(SPF)10～12周齡Wester大鼠80只，雌雄各半，體重(230±20)g。由濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。

1.2 主要儀器與試劑 大蒜素(上海源葉生物科技有限公司)；臺式大容量冷凍離心機(jī)(上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；YXQ602型電熱式蒸汽消毒器(山東新華器械股份有限公司)；Arktik5020型多功能PCR儀(賽默飛世爾科技公司)；實時熒光定量PCR儀(美國伯樂CFX96)；PCR8聯(lián)管(無錫國盛生物工程有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 建立大鼠心肌缺血模型 腹腔注射異丙腎上腺素(3 mg/kg)，每日2次，上午、下午各1次，連續(xù)3周，制造大鼠急性心肌缺血模型。通過檢測心電圖、血清肌鈣蛋白含量確定心肌缺血模型是否構(gòu)建成功。對照組注射等量的生理鹽水。

1.3.2 分組和處理方法 將模型大鼠按照完全隨機(jī)化原則分為4組：大蒜素高、中、低劑量組和模型組，每組12只；另取12只正常大鼠作為正常對照組。高、中、低劑量組分別灌胃大豆油配制的400 mg/kg、200 mg/kg、100 mg/kg濃度的大蒜素，模型組和對照組灌胃等容量的大豆油，等容灌胃量0.1 mL/10 g。

1.4 指標(biāo)測定方法

1.4.1 組織形態(tài)學(xué)觀察 取左心室心尖處心肌組織1～2 mm，放在4%多聚甲醛中固定24 h，常規(guī)脫水、石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，電光鏡觀察大鼠左心室心肌組織的病理變化。

1.4.2 血清和心肌組織中CGRP含量 摘眼球取血，離心取血清，解剖取心臟，制備心肌組織勻漿液，嚴(yán)格按試劑盒說明操作，采用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)測定血清和心肌組織中CGRP含量。

1.4.3 心肌細(xì)胞總RNA 染毒試驗結(jié)束后，取各組大鼠心肌組織，研磨，用生理鹽水洗滌3次。采用Trizol試劑抽提細(xì)胞總RNA，操作步驟根據(jù)說明書進(jìn)行。

1.4.4 引物和內(nèi)參的設(shè)計 從美國國家生物信息中心(NCBI)獲取大鼠CGRP 受體mRNA的基因序列，由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計CGRP受體 mRNA引物。詳見表1。

1.4.5 CGRP受體mRNA熒光定量PCR的產(chǎn)物電泳 將提取出的總RNA電泳分離CGRP受體mRNA，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，進(jìn)行實時熒光定量分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料比較采用方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠的一般情況 在建立模型的過程中，大鼠毛色發(fā)暗，精神狀態(tài)較差，大部分大鼠糞便不成形，稀、軟糞便黏到籠壁和籠底。灌胃大蒜素后，大蒜素各劑量組大鼠的精神狀態(tài)日漸好轉(zhuǎn)，較模型組大鼠更活躍，灌胃過程中模型組大鼠出現(xiàn)感冒、打噴嚏等癥狀，大蒜素各劑量組和對照組大鼠未出現(xiàn)感冒、打噴嚏等癥狀，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抵抗力。

2.2 大鼠心肌組織病理變化 正常對照組大鼠心肌纖維排列整齊，心肌細(xì)胞排列均勻，細(xì)胞充盈；模型組心肌纖維溶解無規(guī)則，心肌細(xì)胞空泡化，大量噬堿性細(xì)胞和炎性細(xì)胞浸潤；大蒜素各劑量組炎性細(xì)胞減少，心肌纖維排列較規(guī)律。詳見圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織病理切片HE染色(×400)

2.3 各組大鼠血清和心肌組織中CGRP含量比較 大蒜素各劑量組與模型組心肌CGRP水平均低于正常對照組(P<0.05)。與模型組比較，大蒜素中、高劑量組心肌組織中CGRP含量升高(P<0.05)。各組血清中CGRP含量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表2。

組別只數(shù)血清CGRP心肌CGRP正常對照組 1241.56±1.9955.15±1.67 模型組 1227.56±4.3748.65±3.40①大蒜素低劑量組1230.43±2.0050.35±2.44①大蒜素中劑量組1239.09±2.8151.85±3.21①②大蒜素高劑量組1239.78±7.5152.05±4.12①②F值1.6789.268P0.1770.000

與正常對照組比較， ①P<0.05；與模型組比較， ②P<0.05。

2.4 PCR羧基熒光素檢測 對提取的總RNA進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增，通過對CGRP mRNA反應(yīng)的擴(kuò)增曲線和溶解曲線進(jìn)行分析表明，mRNA濃度對數(shù)值和循環(huán)閾值之間呈正相關(guān)線性關(guān)系。詳見圖2、圖3。

圖2 CGRP受體 mRNA擴(kuò)增曲線

圖3 CGRP 受體mRNA溶解曲線

2.5 各組大鼠心肌組織CGRP 受體mRNA表達(dá)水平比較 各組大鼠心肌組織CGRP受體mRNA表達(dá)水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=5.800，P=0.001)。與正常對照組比較，大蒜素各劑量組心肌組織CGRP受體mRNA表達(dá)水平均降低(P<0.05)；大蒜素低劑量組、中劑量組CGRP受體 mRNA表達(dá)水平較模型組增高(P<0.05)。表明一定劑量的大蒜素可以在一定范圍內(nèi)提高CGRP 受體mRNA的表達(dá)水平，改善和緩解心肌供血，但不能恢復(fù)到正常水平。詳見表3。

組別只數(shù)CGRP受體mRNA正常對照組 121.32±1.24 模型組 120.55±1.54①大蒜素低劑量組120.78±0.24①②大蒜素中劑量組120.82±0.48①②大蒜素高劑量組120.59±0.26①F值5.800P0.001

與正常對照組比較，①P<0.05；與模型組比較，②P<

0.05。

3 討 論

CGRP是一種短鏈活性生物多肽，由37個氨基酸組成，廣泛分布于周圍和中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，是一種活性很強(qiáng)的擴(kuò)血管物質(zhì)，其擴(kuò)血管作用強(qiáng)于乙酰膽堿、三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)等，CGRP功能多樣，有舒張血管、抑制血管平滑肌細(xì)胞凋亡和增殖等功能[6-7]。國內(nèi)外研究表明，大蒜素對心肌的作用機(jī)制主要包括大蒜素可有效清除超氧陰離子自由基，抗脂質(zhì)過氧化反應(yīng)；促進(jìn)擴(kuò)張血管物質(zhì)產(chǎn)生，如一氧化氮(NO)、硫化氫(H2S)、一氧化氮合成酶(NOS)；在高濃度下抑制心房心肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載鈣拮抗等作用；延緩心肌細(xì)胞凋亡；使心室肌細(xì)胞鈣電流-電壓曲線明顯上移，抑制心肌細(xì)胞L-型鈣通道等[8-14]。大蒜素對心肌收縮力的影響仍存在爭議。

本研究結(jié)果表明，一定劑量的大蒜素可以提高大鼠心肌組織中CGRP受體 mRNA表達(dá)水平，增加血管平滑肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞中CGRP受體的表達(dá)，增強(qiáng)CGRP對心肌血管平滑肌和血管內(nèi)皮細(xì)胞的擴(kuò)血管調(diào)控保護(hù)作用，改善缺血心肌的供血，但是不能恢復(fù)到正常水平，能夠為大蒜素預(yù)防和緩解缺血性心臟病提供理論依據(jù)。