馮冬萍，商漢橋，楊 航,4，張虎軍,4，張 停，楊夢(mèng)溪，屠 強(qiáng),4，任景怡*

(1.北京大學(xué)中日友好臨床醫(yī)學(xué)院， 北京 100029； 2.中日友好醫(yī)院 心內(nèi)科，北京 100029;3.中國(guó)科學(xué)院 遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所， 北京 100101；4.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)， 北京 100049)

動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病(atherosclerotic cardiovascular disease, ASCVD)是全球成人死亡的首要原因[1]。盡管強(qiáng)化他汀治療已使心血管病患者明顯獲益，但心血管疾病仍存在較大剩留風(fēng)險(xiǎn)[2-5]，且與高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol, HDL-C)水平較低相關(guān)[6]。因此，升高HDL-C水平以降低ASCVD剩留風(fēng)險(xiǎn)的策略備受關(guān)注。目前正在研發(fā)的升高HDL-C的相關(guān)治療方法中最受關(guān)注的是膽固醇酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(cholesteryl ester transfer protein, CETP)抑制劑[7]。CETP是主要由肝臟和脂肪組織合成的疏水性糖蛋白，在循環(huán)中CETP與HDL結(jié)合，將膽固醇酯從HDL轉(zhuǎn)運(yùn)至富含載脂蛋白B(apolipoprotein B，ApoB)的極低密度脂蛋白膽固醇(very low-density lipoprotein cholesterol, VLDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C)，同時(shí)將ApoB脂蛋白中的三酰甘油(triglyceride，TG)逆向轉(zhuǎn)運(yùn)給HDL，加速了HDL的分解代謝，在膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中起重要作用[8]。因此，從理論上講，抑制CETP可能是升高HDL-C最有效的藥理作用[9]。

然而，CETP抑制劑相關(guān)臨床試驗(yàn)結(jié)果存在不確定性[10-14]，并且CETP在動(dòng)脈粥樣硬化疾病中的作用機(jī)制尚有很多不明之處[15-16]。CETP抑制劑的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)壳袄щy重重。首先，缺乏合適的疾病動(dòng)物模型。常用的嚙齒類動(dòng)物缺少cetp基因，與人類完全不同，無(wú)法直接用于CETP作用機(jī)制的研究。而將人類CETP引入小鼠，得出的結(jié)果又相互矛盾[17]。其次，在動(dòng)脈粥樣硬化疾病的條件下，CETP對(duì)HDL的影響以及膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)(reverse cholesterol transport，RCT)的作用仍未在體內(nèi)被證實(shí)。迄今為止，尚無(wú)通過(guò)抑制CETP升高HDL水平詳細(xì)機(jī)制的相關(guān)報(bào)告。基于此，尋找更合理的疾病模型對(duì)CETP的研究至關(guān)重要。斑馬魚體型小，易于大量繁殖，胚胎和幼魚透明，全基因組測(cè)序完成，適用于很多種遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、生理學(xué)等技術(shù)手段，是一個(gè)理想的脊椎動(dòng)物模型。更重要的是，斑馬魚擁有保守且與人類高度相似的脂類代謝相關(guān)基因，特別是具有cetp基因，且脂蛋白分布與人類相似，對(duì)高脂食物敏感[18]。因此，斑馬魚非常適合脂代謝及動(dòng)脈粥樣硬化研究，受到了廣泛關(guān)注。

本研究應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除斑馬魚cetp基因，構(gòu)建cetp-/-模型，并且通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序探討cetp基因敲除后其他相關(guān)基因的變化及其相互作用，進(jìn)而揭示CETP在動(dòng)脈粥樣硬化疾病過(guò)程中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

主要試劑：Trizol 試劑(Invitrogen公司)；2×Es Taq MasterMix(北京康為世紀(jì)生物科技公司)；RNeasy Mini kit(Qiagen公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Bio-rad公司)；無(wú)水乙醇(北京化工廠)；3-氨基苯甲酸乙酯甲基磺酸鹽(3-aminobenzoic acid ethyl ester methanesulfonate，MS-222)(Sigma-Aldrich公司)；T7核酸內(nèi)切酶1(T7 endonuclease 1, T7E1)(BioLabs公司)。

1.2 方法

1.2.1 斑馬魚飼養(yǎng)：本實(shí)驗(yàn)所用斑馬魚為野生型Tu品系，其飼養(yǎng)條件為28.5 ℃，pH 7.2～7.6，光照周期為10 h黑暗、14 h光照。斑馬魚繁殖后代方法：即選用健康性成熟的雌、雄斑馬魚，按雄∶雌=1∶1～2的數(shù)量置于產(chǎn)卵盒中，并用透明隔板分離雌、雄斑馬魚，次日移去隔板，收集胚胎。斑馬魚胚胎放入培養(yǎng)液中，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，受精后4～5 d(days post fertilization，dpf)轉(zhuǎn)到魚房并喂食草履蟲，10～14 dpf轉(zhuǎn)入北京愛生公司斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)中養(yǎng)殖喂食豐年蝦，斑馬魚胚胎發(fā)育時(shí)期按照Kimmel等的標(biāo)準(zhǔn)[19]確定。

1.2.2 斑馬魚cetp基因敲除：在NCBI GenBank獲得斑馬魚cetp的全長(zhǎng)序列，應(yīng)用CRISPR/Cas9靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)網(wǎng)站SSC(http://crispr.dfci.harvard.edu/SSC/)設(shè)計(jì)sgRNA。在斑馬魚cetp第2個(gè)外顯子區(qū)域設(shè)計(jì)基因編輯靶位點(diǎn)，其堿基序列為5′-GGG ACCATCAACTATGGATA-3′。此外，設(shè)計(jì)正向引物487f(5′-CTGAAGTCATACAAGCCGC-3′)和反向引物494r(5′-CATTATGCATTAACTTGACT-3′)用于檢測(cè)靶位點(diǎn)是否發(fā)生基因編輯。體外合成sgRNA、Cas9核酸酶mRNA，將sgRNA、Cas9 mRNA及酚紅(指示劑)共孵育配制顯微注射液。收集斑馬魚一細(xì)胞期胚胎并注入上述顯微注射液。對(duì)照組為同一批未注射的斑馬魚胚胎。斑馬魚胚胎顯微注射操作參考John D.Mably等[20-21]的研究。將注射和未注射的斑馬魚胚胎均于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期更換培養(yǎng)液。

收集顯微注射2 dpf胚胎和對(duì)照組胚胎各24枚，分別提取基因組DNA，并通過(guò)PCR反應(yīng)及T7E1酶切確定注射胚胎是否發(fā)生基因編輯。酶切成功樣品的PCR產(chǎn)物送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測(cè)序?；蚓庉嫵晒Φ腇0胚胎飼養(yǎng)至性成熟，并與野生型成魚雜交，所得胚胎提取基因組DNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增、T7E1酶切及測(cè)序，檢測(cè)靶位點(diǎn)突變情況。將突變胚胎飼養(yǎng)至成魚，通過(guò)剪尾提取F1基因組DNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增、T7E1酶切及測(cè)序，確定突變類型，從而獲得cetp基因敲除的雜合突變體，即cetp+/-。同基因型F1雌雄斑馬魚自交后代飼養(yǎng)至成魚，剪尾提取其基因組DNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增、T7E1酶切及測(cè)序，獲得cetp基因敲除純合突變體，即cetp-/-。

1.2.3 斑馬魚標(biāo)本取樣：使用麻醉劑MS-222麻醉成年斑馬魚后，在顯微鏡下分離斑馬魚肝臟，用無(wú)RNA酶的PBS溶液沖洗后置于1 mL Triol中，于-80 ℃冰箱儲(chǔ)存。

1.2.4 RNA提?。喝?80 ℃凍存的肝臟組織，于冰上勻漿。樣品于室溫下靜置5 min后加入200 μL三氯甲烷，充分搖晃15 s后，室溫靜置5 min；4 ℃，15 000×g離心15 min；取400 μL上層液體于新的1.5 mL離心管中，并加入400 μL 70%乙醇吹打混勻。后續(xù)實(shí)驗(yàn)方法按照QIAGEN RNeasy Micro Kit使用說(shuō)明進(jìn)行。

1.2.5 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及分析：首先采用Nano Drop 2000微量分光光度計(jì)及Agilent 2100 Bioanalyzer，Agilent RNA 6000 Nano Kit對(duì)RNA進(jìn)行純度、濃度與完整系數(shù)(RNA integrity number, RIN)檢測(cè)，RIN≥9.0、28S/18S<1.2的RNA用于建庫(kù)、測(cè)序。文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序由北京安諾優(yōu)達(dá)基因科技有限公司采用HiSeq Xten PE500測(cè)序平臺(tái)完成。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)獲得基因表達(dá)譜變化，應(yīng)用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行差異表達(dá)基因功能富集，分析其可能影響的生物學(xué)過(guò)程及信號(hào)通路。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR：采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)檢測(cè)斑馬魚肝臟cetp基因表達(dá)情況。Trizol法提取野生型和cetp-/-斑馬魚肝臟總RNA，以RNA為反轉(zhuǎn)錄模板，應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行RT-qPCR，其中，正向引物為q1-1f：5′-AGCATGCCAAATATCCCAGT-3′，反向引物q1-1r：5′-AGAAGCAAACATATCGTGTAA-3′。 RT-qPCR反應(yīng)程序?yàn)榈?個(gè)循環(huán) 95 ℃ 10 min；第2～41個(gè)循環(huán)95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min；第42循環(huán)熔解曲線。每個(gè)反應(yīng)進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，以β-actin為內(nèi)參對(duì)照，對(duì)照組為外對(duì)照，采用2-ΔΔCt法計(jì)算cetp基因在野生型斑馬魚和cetp-/-斑馬魚肝臟相對(duì)表達(dá)量，應(yīng)用GraphPad prism8繪制柱狀圖。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建cetp-/-斑馬魚模型

為獲得斑馬魚cetp基因敲除純合突變體，本研究應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)斑馬魚cetp基因第2個(gè)外顯子進(jìn)行基因編輯(圖1A)。cetp基因敲除純合突變體遺傳學(xué)篩選流程(圖1B)如下：通過(guò)顯微注射技術(shù)將sgRNA、Cas9 mRNA及酚紅組成的顯微注射液注入野生型斑馬魚一細(xì)胞期胚胎，構(gòu)建F0 founder；F0與野生型斑馬魚交配獲得F1，提取F1基因組DNA，通過(guò)PCR擴(kuò)增及T7E1酶切實(shí)驗(yàn)確定cetp+/-斑馬魚；根據(jù)孟德爾遺傳定律，同基因型F1雌、雄斑馬魚交配即可獲得cetp-/-斑馬魚。采用3對(duì)引物通過(guò)PCR擴(kuò)增、T7E1酶切及瓊脂糖凝膠電泳篩選野生型、雜合體、純合體(圖1C)，其中野生型cetp(泳道3、4、6、15、16, +/+表示)及cetp-/-純合突變體(泳道1、2、9, -/-表示)斑馬魚的PCR產(chǎn)物因不能被T7E1酶切，所以電泳結(jié)果呈現(xiàn)單1條帶(約390 bp)，而cetp+/-雜合突變體(泳道5、7、8、10、11、12、13、14，+/-表示)因雜合雙鏈退火產(chǎn)生非配對(duì)DNA片段，T7E1可識(shí)別不完全配對(duì)DNA并進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物電泳后會(huì)形成2條帶，因而出現(xiàn)約290 bp和360 bp的2條帶。上述cetp基因敲除雜合體和純合體PCR產(chǎn)物進(jìn)行TA克隆測(cè)序(圖1D)，箭頭所示為基因編輯起始位點(diǎn)，產(chǎn)生了增加5個(gè)堿基TCCCT的移碼突變。由此，成功構(gòu)建了cetp-/-斑馬魚模型。

2.2 驗(yàn)證cetp-/-斑馬魚模型

通過(guò)RT-qPCR驗(yàn)證野生型和cetp-/-斑馬魚的肝臟cetp轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示，cetp-/-斑馬魚肝臟中cetp基因表達(dá)量是野生型斑馬魚表達(dá)量的約1/5，cetp-/-斑馬魚肝臟cetp基因表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。

2.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)分析

分別提取野生型和cetp-/-斑馬魚肝臟總RNA，利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析；根據(jù)測(cè)序數(shù)據(jù)分析上述樣品之間的相關(guān)性。結(jié)果顯示，野生型斑馬魚與cetp-/-斑馬魚肝臟樣品分為截然不同的兩類且組內(nèi)相關(guān)性較好，該結(jié)果提示斑馬魚cetp基因敲除成功，與實(shí)驗(yàn)預(yù)期相符，測(cè)序數(shù)據(jù)可進(jìn)行后續(xù)轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析(圖2)。

A.zebrafishcetpgene and knockout site; B.zebrafishcetp-/-model genetics screening process; C.T7E1 assay for detecting CRISPR/Cas9-mediatedcetpgene editing zebrafish; D.sequencing graphs of PCR product from zebrafish; +/+.wild type; +/-.heterozygote; -/-.homozygote

圖1 CRISPR/Cas9介導(dǎo)的斑馬魚cetp基因敲除

Fig 1 CRISPR/Cas9-mediated zebrafishcetpknockout

圖2 野生型和cetp-/-斑馬魚肝臟樣品的相關(guān)性分析

2.4 差異基因表達(dá)分析

從野生型斑馬魚和cetp-/-斑馬魚(測(cè)序)文庫(kù)中，通過(guò)P<0.05篩選表達(dá)量發(fā)生變化的差異表達(dá)基因(圖3)。圖中紅色代表顯著上調(diào)基因，藍(lán)色代表顯著下調(diào)基因。與野生型斑馬魚相比，cetp-/-斑馬魚共篩選到3 808個(gè)發(fā)生顯著變化的基因，其中cetp基因敲除后發(fā)生顯著上調(diào)的基因有1 918個(gè)，顯著下調(diào)的基因有1 890個(gè)。該結(jié)果提示cetp-/-斑馬魚與野生型斑馬魚肝臟基因表達(dá)具有顯著差異。

圖3 野生型和cetp-/-斑馬魚肝臟差異表達(dá)基因

2.5 KEGG分析

將篩選得到的差異表達(dá)基因于KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行通路注釋，通過(guò)顯著性水平(P<0.05)篩選顯著差異的KEGG通路(表1)。其中，上調(diào)基因富集的通路包括溶酶體通路、自噬調(diào)節(jié)通路等；而下調(diào)基因富集的通路包括DNA復(fù)制通路、核糖體通路及三羧酸循環(huán)通路等。

表1 差異表達(dá)基因通路富集列表

3 討論

冠心病已成為全球死亡原因之首，嚴(yán)重威脅人類健康[1, 22]，血脂異常是其主要危險(xiǎn)因素之一[23]。盡管人類CETP突變后其功能缺失可升高血漿HDL-C、降低LDL-C水平、減少心血管事件[24]，然而，CETP抑制劑臨床試驗(yàn)顯示，抑制CETP而升高HDL-C濃度的治療策略并未顯著降低心血管剩留風(fēng)險(xiǎn)[10]。目前，CETP在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用機(jī)制仍未完全明確。因此，尋找理想動(dòng)物模型深入研究CETP在動(dòng)脈粥樣硬化的具體作用機(jī)制可為治療冠心病提供新的治療策略，具有重要臨床意義。斑馬魚以其獨(dú)特的生理優(yōu)勢(shì)、清晰的遺傳背景和豐富的數(shù)據(jù)庫(kù)資源成為重要的脊椎動(dòng)物模型。更為重要的是，斑馬魚具有cetp基因，其脂蛋白分布和人類相似，使其在脂質(zhì)代謝及動(dòng)脈粥樣硬化疾病的研究中獨(dú)具優(yōu)勢(shì)[18, 25-27]。第三代基因組編輯技術(shù)CRISPR/Cas9是在sgRNA引導(dǎo)下使cas9蛋白定位到DNA靶序列上，對(duì)DNA雙鏈進(jìn)行切割，實(shí)現(xiàn)基因編輯，具有設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、操作方便、切割效率高等優(yōu)勢(shì)[28]。

本研究通過(guò)CRISPR/Cas9和顯微注射技術(shù)敲除斑馬魚cetp基因，構(gòu)建斑馬魚cetp-/-模型，并且分別對(duì)野生型和cetp-/-斑馬魚肝臟進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序。經(jīng)轉(zhuǎn)錄組分析，本研究共篩選到3 808個(gè)差異表達(dá)基因，并對(duì)其進(jìn)行KEGG富集分析，結(jié)果顯示，敲除斑馬魚cetp基因后，abca1、abcg2a基因顯著上調(diào)；lipg基因顯著下調(diào)。Bochem等[29]研究顯示，因三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1(adenosine triphosphate-binding cassette transporter A1，ABCA1)突變導(dǎo)致ABCA1功能喪失后，頸動(dòng)脈粥樣硬化增加，CVD風(fēng)險(xiǎn)增加，上調(diào)ABCA1成為治療CVD的有效治療策略。內(nèi)皮脂酶是由lipg基因編碼產(chǎn)生的脂肪酶，主要參與脂蛋白代謝過(guò)程，是HDL代謝中的關(guān)鍵蛋白。Ishida等[30]將小鼠Lipg敲除后，血漿HDL顆粒直徑變大，HDL水平升高，HDL清除延遲；而將Lipg轉(zhuǎn)入小鼠體內(nèi)后，血漿HDL水平降低。此外，人類中LIPG功能丟失，HDL水平顯著升高[31]。本研究中敲除斑馬魚cetp基因后abca1、abcg2a基因顯著上調(diào)；lipg基因顯著下調(diào)，可能cetp-/-斑馬魚的Hdl水平升高，具有抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，與野生型斑馬魚相比，cetp-/-斑馬魚顯著上調(diào)基因主要富集到自噬相關(guān)通路，提示敲除cetp后斑馬魚自噬作用明顯增強(qiáng)。研究表明，自噬與炎性反應(yīng)相互影響，二者均在動(dòng)脈粥樣硬化中具有重要作用，適度自噬反應(yīng)對(duì)機(jī)體具有保護(hù)作用，而過(guò)度自噬會(huì)引發(fā)細(xì)胞死亡及促進(jìn)炎性因子分泌，可能加速動(dòng)脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定[32-36]。新近的CANTOS研究首次證實(shí)抑制炎性反應(yīng)可降低不良心血管事件，為動(dòng)脈粥樣硬化的炎性反應(yīng)假說(shuō)提供直接證據(jù)[37]。因此，敲除cetp后斑馬魚的自噬作用顯著增加，促進(jìn)炎性反應(yīng)，可能具有促動(dòng)脈粥樣硬化的作用。

綜上所述，盡管敲除斑馬魚cetp可導(dǎo)致血漿Hdl升高，改變脂質(zhì)代謝，降低動(dòng)脈粥樣硬化風(fēng)險(xiǎn)，但是敲除cetp后會(huì)激活自噬，增加炎性反應(yīng)，具有促動(dòng)脈粥樣硬化作用。本研究結(jié)果表明，CETP在動(dòng)脈粥樣硬化中具有抗動(dòng)脈粥樣硬化和促動(dòng)脈粥樣硬化雙向調(diào)節(jié)作用，CETP在炎性反應(yīng)中的具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。