焦亞飛，劉樹林，葉 升，石德順，黃 奔

（廣西大學 動物科學技術(shù)學院／亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室，南寧 530004）

卵母細胞是生殖醫(yī)學、細胞生物學、物種保護等領(lǐng)域的重要研究對象［1］。與雄性配子相比，卵母細胞可在體外培養(yǎng)成熟。卵母細胞的成熟質(zhì)量對體外受精（in vitro fertilization，IVF）、體細胞核移植（somatic nuclear transfer，NT）和孤雌激活（parthenogenetic activation，PA）后的胚胎發(fā)育有重要影響，但體外成熟卵母細胞的質(zhì)量遠低于體內(nèi)成熟。與體內(nèi)成熟的卵母細胞相比，體外成熟的豬卵母細胞常常發(fā)生多精受精率高、囊胚發(fā)育率低、卵母細胞核質(zhì)成熟不同步等問題［2］。

近年來，研究人員致力于通過添加激素和細胞因子來提高卵母細胞的發(fā)育潛能，如添加生長因子、激素以及信號通路的抑制劑和激活劑以改變卵丘卵母細胞復合物（cumulus oocyte complexes，COCs）的蛋白質(zhì)活性［3－4］。蛋白激酶B／Akt是一種絲氨酸／蘇氨酸（Ser／Thr）激酶，是磷脂酰肌醇－3－激酶／PKB（PI3K／Akt）通路中的信號元件。在哺乳動物的卵母細胞中，Akt信號通路的激活與減數(shù)分裂的進程密切相關(guān)，Akt信號通路的相關(guān)基因表達均能在體外成熟培養(yǎng)的卵母細胞和卵丘細胞中檢測到［5－6］。研究表明，雖然Akt激活不是誘導胚泡破裂（germ vesicle breakdown，GVBD）所必需的，但在減數(shù)分裂過程中從Ⅰ期（MetaphaseⅠ，MⅠ）向Ⅱ期（metaphaseⅡ，MⅡ）過渡時需要Akt激活［7］。然而，有關(guān)PI3K／Akt信號通路與豬體外成熟卵母細胞發(fā)育潛能獲得關(guān)系的研究報道較少。為此，本研究擬通過在成熟培養(yǎng)液中加入PI3K／Akt激活劑——表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF），檢測分析卵母細胞成熟率和發(fā)育潛能的變化，以及PI3K／Akt信號通路相關(guān)基因表達情況，以闡明PI3K／Akt信號通路與豬卵母細胞成熟質(zhì)量的關(guān)系，完善豬卵母細胞的體外成熟技術(shù)方法，為轉(zhuǎn)基因豬等胚胎生物技術(shù)的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 卵巢

離體豬卵巢，取自廣西南寧市屠宰廠，2 h內(nèi)運到實驗室。試驗所用胚胎為孤雌胚胎。

1.2 主要儀器、設(shè)備及試劑

BIO－RAD凝膠成像系統(tǒng)，購自Bid－Rad公司；超凈工作臺，購自德國Thermo公司；體視顯微鏡，購自日本Nikon公司；EGF，購自上海藍木化工有限公司；RNA提取和RT－PCR試劑盒，購自賽默飛世爾科技公司；抗體p－Akt（phosphorylation Thr308），購自CST公司；孕馬血清激素（PMSG），來源于上海市計劃生育研究所；人絨毛膜促性腺激素（hCG），購自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS），購自Hyclone公司；細胞裂解液（cells－to－cDNATMⅡ）Kit，購自Ambion公司；TCM199，購自Gibco公司。

豬卵母細胞成熟液、卵母細胞洗液及胚胎培養(yǎng)液，參照參考文獻［8］制作。

1.3 豬GV期卵母細胞的收集與體外成熟培養(yǎng)

用剪刀除去豬卵巢表面的系膜組織，放入裝有生理鹽水的保溫壺中，在1～2 h內(nèi)運回實驗室。選取卵巢表面直徑為3～8 mm的卵泡，用10 mL注射器抽取卵泡液，回收卵母細胞。獲取的卵泡液置于玻璃試管中，在39℃水浴靜置沉淀15 min；棄去試管1／3～2／3的卵泡液，加入CCM液，在體視顯微鏡下挑選胞質(zhì)均勻、卵丘顆粒層3層以上的COCs；挑選出的COCs用CCM 液清洗3遍，置于150μL含激素的成熟液滴（每滴30個左右，上覆礦物油）中，在37℃、5%CO2的最大飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)22～24 h；然后在不加激素的成熟培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)20～22 h。試驗分為4組，分別為0（對照），5，10，20 ng／mL EGF組。

1.4 豬卵母細胞的孤雌激活與早期胚胎培養(yǎng)

將電極槽按正負極安裝好，用移液槍將電激活液注入電極槽，并在中間做一個液滴，把卵母細胞水平排列在電極槽內(nèi)；然后施加激活參數(shù)為50 V／mm、80μs的3次脈沖；最后將經(jīng)激活處理的卵母細胞放入平衡好的胚胎培養(yǎng)液滴中（30μL，每滴5～8枚），上覆礦物油，在37℃、5%CO2、最大飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。培養(yǎng)1 d后統(tǒng)計2－細胞數(shù)，2 d后統(tǒng)計4－細胞數(shù)，7 d后統(tǒng)計囊胚數(shù)。

1.5 豬卵母細胞微量反轉(zhuǎn)錄和RT－qPCR反應

對不含EGF和10 ng／mL EGF成熟液中培養(yǎng)44～46 h的豬卵母細胞的GDF9、BMP15、Akt、CDC2、細胞周期蛋白B（CyclinB1）、MOS和P34基因表達情況進行RT－qPCR分析。

將成熟的卵母細胞放入裝有8μL裂解液的EP管中，每管放5～8個卵母細胞。收集過程應該在冰上進行并且稍帶液體。一部分用來進行反轉(zhuǎn)錄，另一部分保存于－80℃冰箱。

反轉(zhuǎn)錄過程主要按照試劑盒說明書步驟并進行了一些改進：（1）DNA基因組去除全程應在冰上操作，每管加入1μL 10×dsDNase Buffer、1μL ds-DNase至10μL反應體系；混勻，離心，37℃孵育2 min，取出放于冰上。（2）基因組DNA消除后，將下列試劑按指定順序加入同一試管中：0.25μL oligo（DT）18 Primer、0.25 μL random hexamer primer、1μL 10 mmol／L dNTP Mix，再加nucleasefree水至15μL，振蕩混勻，離心，65℃孵育5 min。（3）孵育后按順序?qū)⑾铝薪M分加入反應管中：4μL 5×RT Buffer、1μL Maxima H Minus Enzyme Mix，振蕩混勻，離心，最終體積為20μL。然后進行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄過程見表1。逆轉(zhuǎn)錄反應產(chǎn)物可直接用于qPCR，也可在－20℃保存1周。如需存儲更長時間，建議在－70℃保存，以避免cDNA循環(huán)凍融。

表1 反轉(zhuǎn)錄過程 min

采用經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA作為模板，進行qPCR反應。反應程序：95℃預變性15 min；95℃退火1 min；60℃延伸30 s。在定量儀中循環(huán)40次。qPCR反應體系見表2。內(nèi)參基因使用GAPDH，目的基因的引物序列見表3。

表2 qPCR反應體系 μL

表3 qPCR反應引物序列及反應條件

1.6 Western blot檢測卵母細胞p－Akt蛋白表達

收集成熟培養(yǎng)44～46 h后的卵母細胞，用0.1%透明質(zhì)酸酶消化卵丘細胞，進行卵母細胞蛋白的提取，制備SDS－PAGE分離膠和濃縮膠，進行電泳；然后采用半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜2 h，待蛋白轉(zhuǎn)到膜上后用脫脂奶粉進行封閉；用TBST（雜交膜清洗液）稀釋一抗兔多克隆抗體p－Akt（1∶1 000稀釋），4℃冰箱過夜孵育，內(nèi)參使用GAPDH（1∶5 000稀釋）。加入稀釋好的HRP標記的山羊抗兔二抗（1∶5 000）稀釋，孵育后用TBST搖床振蕩洗滌，最后用二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，在BIO－RAD成像系統(tǒng)進行曝光成像，再用Image J軟件對條帶灰度值進行分析。試驗均重復3次。

1.7 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析。多組間比較采用單因素方差分析法，多重比較采用鄧肯氏比較法。P＞0.05為差異不顯著，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 EGF對卵丘細胞擴展的影響

結(jié)果見圖1。

由圖1可以看出，5，10 ng／mL EGF組經(jīng)過44～46 h培養(yǎng)，卵丘細胞的擴展程度明顯好于對照組，而20 ng／mL EGF組卵丘細胞的擴展程度與對照組無明顯差別。

圖1 添加不同濃度EGF對卵丘擴展的影響（40×）

2.2 EGF對豬卵母細胞體外成熟及孤雌發(fā)育的影響

結(jié)果見表4。

由表4可以看出，10 ng／mL EGF組經(jīng)過44～46 h培養(yǎng)，第一極體排出率顯著高于其余各組（P＜0.05），且孤雌激活后的2－細胞率、4－細胞率和囊胚率也顯著高于其余各組（P＜0.05）。

表4 豬卵母細胞體外成熟及孤雌發(fā)育指標測定結(jié)果

2.3 EGF對卵母細胞成熟相關(guān)基因表達的影響

結(jié)果見圖2。

由圖2可以看出，與對照組相比，10 ng／mL EGF組的GDF9、Akt、CDC2、CyclinB1和MOS基因表達水平均顯著上調(diào)（P＜0.05），P34基因的表達水平極顯著上調(diào)（P＜0.01），BMP15基因表達略有上調(diào)（P＞0.05）。

圖2 不同濃度EGF處理對卵母細胞成熟相關(guān)基因表達的影響結(jié)果

2.4 EGF對豬卵母細胞p－Akt蛋白表達的影響

為探討EGF對豬卵母細胞p－Akt蛋白表達的影響，應用Western blot對對照組和10 ng／mL EGF組培養(yǎng)44～46 h的200枚豬卵母細胞進行了p－Akt蛋白檢測分析，結(jié)果見圖3。

由圖3可以看出，10 ng／mL EGF組的Akt磷酸化水平（蛋白相對豐度）顯著高于對照組（P＜0.05）。

圖3 EGF對豬卵母細胞p－Akt蛋白表達的影響結(jié)果

3 討論

PI3K／Akt信號通路被認為是最重要的細胞內(nèi)通路之一，它在癌癥、細胞增殖、胚胎干細胞和胚胎發(fā)生等生命過程中起著重要作用。近年來，越來越多的報道證實PI3K／Akt和一些下游效應分子組成的信號通路成分在卵泡形成、生長、排卵和黃體化過程中發(fā)生變化［9－10］，提示PI3K／Akt對卵巢卵泡發(fā)育有重要作用。先前的研究表明，PI3K／Akt通過誘導CDC25磷酸酶家族成員CDC25B的Akt依賴性磷酸化，引起成熟促進因子（maturation promoting factor，MPF）的激活，并強烈促進單細胞期小鼠受精卵的發(fā)育。該研究表明，在卵母細胞和早期發(fā)育過程中PI3K／Akt通路非常重要。本研究探討了PI3K／Akt信號激活劑EGF對豬卵母細胞成熟及其早期胚胎發(fā)育能力的影響，還檢測了與卵母細胞成熟相關(guān)的幾個基因的表達，以驗證PI3K／Akt信號通路的激活對卵母細胞成熟的作用。說明EGF對PI3K／Akt信號通路的激活對豬卵母細胞成熟有積極的影響。

本試驗中，加入EGF后卵母細胞成熟相關(guān)基因表達發(fā)生了改變。Akt基因是PI3K信號通路的重要組成部分，其mRNA表達受EGF處理的影響?？梢酝茢啵擡GF發(fā)揮激活作用時促進了Akt的轉(zhuǎn)錄表達。本試驗還研究了與卵母細胞成熟相關(guān)的其他候選基因。CyclinB1和CDC2是成熟促進因子（MPF）的重要組成部分。MPF是一種激酶，可以使細胞從G2期進入M 期［11］。本試驗中，10 ng／mL EGF組CyclinB1表達量與對照組相比顯著提高。多項研究表明，在減數(shù)分裂能力恢復過程中，CyclinB1豐度（表達量）保持一定，而CDC2增加了幾倍［12］。事實上，這些研究結(jié)果一致表明CDC2可能是卵母細胞減數(shù)分裂能力恢復的關(guān)鍵成分［13］，可以認為CDC2高表達的卵母細胞更容易成熟。本試驗結(jié)果表明，EGF處理的卵母細胞有成熟的潛力。哺乳動物的卵母細胞積累一些母體的轉(zhuǎn)錄本，使之成熟并開始早期胚胎發(fā)育［14］。GDF9、BMP15和MOS是與卵母細胞成熟相關(guān)的三個關(guān)鍵母源性基因［15］。10 ng／mLEGF組卵母細胞BMP15表達量上調(diào)，但與對照組差異不顯著，而GDF9表達量顯著高于對照組。由此可以推測，PI3K／Akt信號通路的激活可能會調(diào)節(jié)母體基因（如CDC2、GDF9、BMP15、MOS等），從而促進卵母細胞成熟。

Akt在兩個關(guān)鍵殘基Thr308和Ser473磷酸化后被激活，并根據(jù)這些磷酸化位點發(fā)揮不同的細胞效應。Thr308位點的磷酸化與抗凋亡功能相關(guān)，而Ser473位點的磷酸化則調(diào)節(jié)細胞存活和增殖［16］。激活的Akt參與哺乳動物卵母細胞減數(shù)分裂的恢復［17］，Ser473和Thr308位點的磷酸化在卵母細胞成熟的不同階段都可以檢測到。研究發(fā)現(xiàn)，在卵母細胞生發(fā)泡破裂（GVBD）培養(yǎng)15 h后檢測到磷酸化Ser473，在培養(yǎng)24 h后檢測到磷酸化Thr308［18］。此外，磷酸化Ser473定位于核膜和中心體區(qū)域，而磷酸化Thr308僅定位于中心體，這說明磷酸化位點的定位很明顯［19］。本試驗中，添加EGF后Akt磷酸化水平升高，證實EGF通過上調(diào)Akt活性促進了卵母細胞成熟；通過添加EGF提高了豬卵母細胞成熟率，這為提高其他物種卵母細胞成熟率提供了參考。