白方會(huì)，張保朝，徐茜，賈東佩，胡科，陳寶田，李慧

(1. 河南省南陽(yáng)市中心醫(yī)院，河南 南陽(yáng) 473000；2. 南陽(yáng)師范學(xué)院，河南 南陽(yáng) 473000；3. 南方醫(yī)科大學(xué)，廣東 廣州 510515；4. 廣東省廣州市紅十字會(huì)醫(yī)院，廣東 廣州 510220)

原發(fā)性頭痛中以偏頭痛最常見(jiàn)，呈反復(fù)發(fā)作性，以半側(cè)或雙側(cè)頭部跳痛為特點(diǎn)，惡心嘔吐是其常見(jiàn)伴隨癥狀，勞累和聲、光刺激是其主要誘發(fā)或加重因素[1]。最新調(diào)查表明，偏頭痛是人類第6個(gè)易患疾病，其致殘率為全球第2位[2]，由此可知，偏頭痛是威脅人類健康的最大的功能性疾病。我國(guó)偏頭痛年患病率為9.3%，其中女性患病率是男性的3倍[3]。C1-C2頸髓背側(cè)核至三叉神經(jīng)脊束核尾部(trigeminal nucleus caudalis，TNC)統(tǒng)稱為三叉神經(jīng)頸髓復(fù)合體(trigeminal nerve cervical spinal complex，TCC)[4]，是三叉神經(jīng)二級(jí)神經(jīng)元，是偏頭痛發(fā)生時(shí)信號(hào)傳遞的重要部位。三叉神經(jīng)脊束核尾部有TRPV1通道存在，TRPV1受體的活化在偏頭痛發(fā)生與痛覺(jué)過(guò)敏形成中均起重要作用[5-7]。正天丸臨床應(yīng)用30余年，有較好療效與較高安全性，但其作用機(jī)制尚未明確。本研究通過(guò)檢測(cè)偏頭痛大鼠TCC內(nèi)TRPV1受體的水平，以探討正天丸的作用靶點(diǎn)。現(xiàn)報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD雄性大鼠24只，平均周齡(10.1±1.3)周；平均體質(zhì)量 (270±30) g。由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，飼養(yǎng)條件：室溫23℃～26℃，光暗周期12 h，相對(duì)濕度40%～60%，自由進(jìn)食水，待大鼠適應(yīng)7 d后干預(yù)。實(shí)驗(yàn)遵從《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》的規(guī)定[8]。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑 正天丸(華潤(rùn)三九，批號(hào)：1308002H)、硝酸甘油注射液(益民藥業(yè)，批號(hào)：131122)、熒光二抗-Cy3(凱基生物)、VR1兔多克隆抗體(Santa Cruz)、β-actin(中杉金橋)、PVDF膜(Millipore)、ECL發(fā)光液和BCA試劑盒(碧云天)、IS 2000 MM圖像工作站(Kodak)。

1.3 偏頭痛模型的建立 隨機(jī)將24只大鼠分為空白組、偏頭痛組、正天丸組，每組8只。正天丸組每天灌胃一次正天丸(1.62 g/kg)；其余兩組灌胃1 ml 0.9% NaCl，連續(xù)給藥7 d，末次給藥30 min后空白組皮下注射0.9% NaCl溶液0.5 ml，其余兩組大鼠頸背部皮下注射硝酸甘油(10 mg/kg)，制造偏頭痛模型[9]。

1.4 行為學(xué)觀察 當(dāng)大鼠出現(xiàn)頻繁用前肢撓頭、耳朵發(fā)紅、轉(zhuǎn)圈、爬籠等不安表現(xiàn)提示造模成功[5]。根據(jù)前期研究結(jié)果，觀察造模后3 h內(nèi)行為學(xué)表現(xiàn)。以每30 min作為一個(gè)觀察時(shí)間段，頭痛開(kāi)始以30 min內(nèi)連續(xù)撓頭5次以上為標(biāo)志，頭痛消失以 30 min內(nèi)撓頭次數(shù)低于5次為標(biāo)志。

1.5 標(biāo)本采集與指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 Western blotting 造模4 h后，大鼠麻醉后迅速冰上取材，裂解組織，BCA法測(cè)定蛋白濃度，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉1 h，TBST沖洗3次，加入一抗(1∶1000)，4℃孵育過(guò)夜，羊抗兔二抗(1∶3000)室溫孵育1 h，采用ECL化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行曝光拍照，Molecular Imaging Software Version 4.0(Kodak)軟件分析條帶灰度值，每組重復(fù)檢測(cè)3次，以β-actin為內(nèi)參。

1.5.2 免疫熒光 造模4 h后灌注固定，開(kāi)顱取出全腦連至頸2以下頸髓，繼續(xù)固定24 h，脫水、石蠟切片，片厚約10 μm。切片順次脫蠟、水化、熱抗原修復(fù)和滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶后， BSA封閉后加入TRPV1一抗(1∶500)，4℃過(guò)夜，滴加Cy3熒光二抗(1∶500)，避光孵育1 h，倒置顯微鏡下觀察結(jié)果，顯現(xiàn)紅色為T(mén)RPV1表達(dá)陽(yáng)性，空白組以PBS作一抗。

1.5.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 麻醉后冰上快速分離大鼠TCC，-80℃保存。TRPV1總RNA的提取和cDNA的轉(zhuǎn)錄均按照相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，25℃ 反應(yīng)10 min→37℃反應(yīng)1 h→95℃反應(yīng)5 min。以GAPDH為內(nèi)參照，由上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行引物合成，建立20 μl的PCR反應(yīng)體系：其中dH2O 7 μl，各1 μl上下游引物，1 μl cDNA，10 μl的Taq酶。PCR反應(yīng)條件：95℃ 10 s，95℃ 10 s，58℃ 5 s，72℃10 s，共45個(gè)循環(huán)。PCR儀讀取TRPV1與GAPDH的循環(huán)閾值，根據(jù)相對(duì)定量法(2-△△CT)計(jì)算各樣本TRPV1mRNA的△CT值：△CT=目的基因CT-內(nèi)參基因CT。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)表現(xiàn) 自造模后10 min起，偏頭痛組和正天丸組大鼠紛紛出現(xiàn)不斷爬籠、轉(zhuǎn)圈等行為，耳朵開(kāi)始發(fā)紅，頻繁快速撓頭，標(biāo)志造模成功。偏頭痛組和正天丸組撓頭表現(xiàn)在造模后1 h內(nèi)最明顯，正天丸組大鼠大約造模1.5 h以后未再出現(xiàn)連續(xù)撓頭5次以上表現(xiàn)，耳紅消失，蜷臥不動(dòng)；偏頭痛組大鼠造模2.5 h以后未再出現(xiàn)連續(xù)撓頭5次以上表現(xiàn)，耳紅消失，活動(dòng)明顯減少，倦怠不動(dòng)?？瞻捉M大鼠僅皮下注射0.9% NaCl溶液，30 min內(nèi)有間斷撓頭表現(xiàn)，隨后撓頭不明顯，一直未見(jiàn)耳朵發(fā)紅。

2.2 正天丸對(duì)TCC中TRPV1受體表達(dá)的影響

2.2.1 免疫熒光結(jié)果 免疫熒光結(jié)果表明，TRPV1在每組大鼠TCC內(nèi)均可見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)(圖中箭頭所示紅色高亮部分)。從圖1可見(jiàn)，偏頭痛組大鼠TCC內(nèi)可見(jiàn)TRPV1明顯高表達(dá)，正天丸組表達(dá)強(qiáng)度低于偏頭痛組，空白組也可見(jiàn)TRPV1輕度陽(yáng)性表達(dá)(見(jiàn)圖1)。

圖1 各組大鼠TCC中TRPV1的表達(dá)(×100)注：A：空白組，B：偏頭痛組，C：正天丸組。

2.2.2 Western blotting結(jié)果 結(jié)果顯示TRPV1/β-actin的比值分別為：空白組(0.35±0.04)，偏頭痛組(0.86±0.01)，正天丸組(0.70±0.03)。偏頭痛組TRPV1蛋白表達(dá)較空白組顯著增高(t=37.51，P<0.001)；與偏頭痛組相比，正天丸組TRPV1蛋白表達(dá)顯著降低(t=-13.907，P<0.05)，見(jiàn)圖2。

圖2 三叉神經(jīng)頸髓復(fù)合體中TRPV1蛋白的表達(dá)注：##與偏頭痛組比，P<0.001。

2.2.3 PCR結(jié)果 以GAPDH為內(nèi)參將TRPV1的灰度值進(jìn)行標(biāo)化，結(jié)果如下：空白組(0.995±0.010)、偏頭痛組(2.57±0.37)、正天丸組(1.71±0.25)。偏頭痛組TRPV1 mRNA表達(dá)較空白組明顯增加(t=-4.009，P=0.005)，正天丸組TRPV1 mRNA表達(dá)較偏頭痛組明顯降低(F=37.149，P<0.001)，見(jiàn)圖3。

圖3 三叉神經(jīng)頸髓復(fù)合體TRPV1受體mRNA的表達(dá)注：#與偏頭痛組比，P<0.001

3 討論

在中醫(yī)古籍中偏頭痛又名“邊頭風(fēng)”“偏頭風(fēng)”。自《黃帝內(nèi)經(jīng)》以來(lái)，歷代醫(yī)書(shū)均有對(duì)偏頭痛理法方藥的記載，偏頭痛多為本虛標(biāo)實(shí)之證，病位在腦髓經(jīng)絡(luò)，與肝、脾、腎三臟關(guān)系密切[10-11]。多風(fēng)、多瘀、多濕、多虛是多年來(lái)陳寶田教授對(duì)偏頭痛患者病理機(jī)制特點(diǎn)的總結(jié)。陳教授吸取川芎茶調(diào)散、麻黃附子細(xì)辛湯、桃紅四物湯、四藤消震飲四方之精華，于1985年創(chuàng)制正天丸。川芎性味辛溫，功善祛風(fēng)止痛、活血行氣，為該方之君藥，自古有“頭痛需用川芎”之說(shuō)法。正天丸綜合各方之長(zhǎng)，具有疏風(fēng)通絡(luò)、活血止痛、養(yǎng)血平肝之功，30余年來(lái)以其卓著的療效得到廣大患者及醫(yī)生的好評(píng)，并遠(yuǎn)銷海外。臨床隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)(RCT)研究表明，正天丸能有效減輕患者的頭痛強(qiáng)度，減少發(fā)作次數(shù)，并縮短頭痛持續(xù)時(shí)間，臨床療效確切，且無(wú)明顯不良反應(yīng)[12]。但其具體作用機(jī)制尚未明確。

TCC是偏頭痛發(fā)作時(shí)傷害性信息由顱外向顱內(nèi)傳導(dǎo)的重要二級(jí)神經(jīng)元，偏頭痛患者常伴的惡心嘔吐表現(xiàn)也是由TCC發(fā)出信號(hào)刺激延髓嘔吐中樞所致[13]。TRPV1受體又稱香草酸受體亞型1(VR1)或辣椒素受體，是TRP亞家族中首個(gè)用于偏頭痛研究的成員。研究顯示背根神經(jīng)節(jié)、三叉神經(jīng)節(jié)、三叉神經(jīng)背束核尾部(TNC)、硬腦膜、藍(lán)斑和下丘腦均有TRPV1通道存在，在偏頭痛和其它神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)病機(jī)制中起特定作用[5，14-15]。緩激肽、前列腺素、低pH值、辣椒素、炎性分泌物等炎性因子可以興奮TRPV1，使局部腦膜CGRP釋放增加，腦膜血管擴(kuò)張、血流加速，TCC興奮性增加，從而介導(dǎo)偏頭痛的發(fā)作[16-17]。小鼠敲除TRPV1受體后，傷害性信息的傳遞明顯減少，疼痛反應(yīng)出現(xiàn)的時(shí)間明顯推后[18]。

我們的結(jié)果顯示：生理狀態(tài)下大鼠TCC神經(jīng)元既有TRPV1受體較低水平的表達(dá)，免疫熒光結(jié)果可以直觀地顯示偏頭痛組大鼠TRPV1受體表達(dá)亮度較空白組明顯增高。Western blotting和RT-PCR結(jié)果顯示偏頭痛組大鼠TCC內(nèi)TRPV1受體蛋白和基因表達(dá)水平均較正常組大鼠顯著增高，印證了TRPV1受體的活化參與了偏頭痛發(fā)作過(guò)程中的痛覺(jué)信息傳遞。正天丸組行為學(xué)表現(xiàn)持續(xù)時(shí)間較偏頭痛組明顯縮短，證實(shí)了正天丸的有效性，其TRPV1受體蛋白和基因表達(dá)較偏頭痛組明顯降低，表明正天丸可以抑制TRPV1受體的過(guò)表達(dá)從而抑制疼痛信號(hào)在TCC中的傳遞起到治療偏頭痛的作用。