肖彩仙 段 恒 袁真英

（重慶醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院， 中醫(yī)藥防治代謝性疾病重慶市重點實驗室， 重慶400016）

卵母細胞的體外成熟（in vitro maturation，IVM） 作為體外授精-胚胎移植衍生的新興技術，與傳統(tǒng)的體外受精-胚胎移植技術相比，卵母細胞的體外成熟避免了卵巢過度刺激綜合征的發(fā)生，可以為因遺傳、免疫及分泌等因素而不孕的患者提供成熟卵母細胞，為治療不孕提供一條新途徑［1］。但是由于卵母細胞體外成熟率低，臨床妊娠率仍徘徊在35%～40%［2］。補腎中藥介入輔助生殖技術具有提高卵細胞質量的作用，前期動物實驗也證實了養(yǎng)精種玉湯可以促進卵母細胞的成熟［3］。因此，本實驗旨在前期研究基礎之上，進一步探討?zhàn)B精種玉湯促卵母細胞體外成熟的機制。

1 材料

1.1 動物 8～10 周齡雌性SPF 級KM 小鼠65 只，體質量25～30 g，12 周齡雄性SPF 級KM 小鼠20 只，體質量30～35 g，購自重慶醫(yī)科大學動物實驗中心。使用許可證號SYXK（渝） 2018-0003。

1.2 藥物 養(yǎng)精種玉湯由熟地、當歸、白芍、山萸肉（2∶1∶1∶1）組成，藥材購自重慶桐君閣大藥房連鎖有限責任公司，經中藥鑒定師費耀副教授根據2015 版《中國藥典》 鑒定為正品，養(yǎng)精種玉湯由重慶醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院中藥教研室制備成1.5 g 生藥／mL 浸膏；孕馬血清促性腺激素（PMSG，1 000 U／支，批號110044564） 購自浙江省寧波市三生藥業(yè)有限公司生產；注射用尿促卵泡激素（FSH，75 U／瓶，批號H20052130，麗珠集團麗珠制藥廠）。

1.3 試劑 M199 培養(yǎng)基（美國Gibco 公司，貨號12340030）；胎牛血清（以色列BI 公司，貨號04-400-1B）；石蠟油（美國Sigma 公司，貨號8042-47-5）；TritonX-100（北京索萊寶科技有限公司，貨號T8200）；DAPI（北京索萊寶科技有限公司，貨號C0065）；VEGF-A 抗體（英國Abcam 公司，貨號ab52917）；cdc2 抗體（美國GeneTex 公司，貨號GTX108120）；DyLightTM488（美國KPL 公司，貨號042-03-15-06）；RNA 提取試劑盒（美國Axygen 公司，貨號AP-MN-MS-RNA-50）；逆轉錄試劑盒（美國Bimake 公司，貨號B24403）；SYBR（日本Takara 公司，貨號RR820 A）；VEGF-A、cdc2 引物由北京擎科生物科技有限公司合成。

1.4 儀器 Hypersil ODS2（250 mm×4.6 mm，5 μm，大連依利特分析儀器有限公司）；LC-20 A型高效液相色譜儀（美國Thermo 公司）；CO2細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo 公司）；XTL-400 體視顯微鏡（重慶澳浦光電技術有限公司）；BX53 熒光顯微鏡（日本Olympus 公司）；ND 2000 超微量核酸測定儀（美國Thermo 公司）；CFX PCR 檢測系統(tǒng)（美國Bio Rad 公司）。

2 方法

2.1 養(yǎng)精種玉湯小鼠血清制備 雌性小鼠按20 g／kg 劑量灌胃養(yǎng)精種玉湯，正常組給予生理鹽水，1 次／d，連續(xù)3 d。小鼠灌胃后0.5、1、1.5、2、4 h 摘眼球取血，制備血清。取含藥血清0.5 mL，用移液槍加入1 mL 乙腈，混勻離心，取上清用0.22 μm 微孔濾膜過濾。流動相乙腈（A） -0.1%磷酸（B）；體積流量1.0 mL／min；柱溫30℃；紫外檢測波長225 nm；進樣量10 μL；進行HPLC 分析，確定藥效峰值最高的時間點。

2.2 小鼠卵母細胞采集 雌鼠腹腔注射PMSG 10 IU／只，48 h 后脫頸處死，取出卵巢，在解剖鏡下，用1 mL 注射器針尖刺破卵泡，釋放未成熟的卵母細胞-顆粒細胞復合體（oocyte-granulos cell complexes，OCCs）。移入覆蓋石蠟油的M199 培養(yǎng)液中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

2.3 分組 收集OCCs 分為空白組、空白血清組、養(yǎng)精種玉湯血清組、FSH組，空白組加入10%的胎牛血清，空白血清組、養(yǎng)精種玉湯血清組、FSH組分別再加入2%小鼠血清、2%養(yǎng)精種玉湯小鼠血清、FSH（1.5 U／mL）。

2.4 卵母細胞成熟率測定 各組OCCs 細胞培養(yǎng)24 h 后，用透明質酸酶處理OCCs 成為裸卵，并以第一極體排出為卵母細胞成熟標志，計算成熟率＝（成熟個數／卵母細胞個數） ×100%。

2.5 小鼠體外受精及卵裂觀察 將雄性小鼠脫頸處死，取出附睪尾，用眼科剪剪成段，釋出精子于M199＋10%胎牛血清培養(yǎng)液中，放入培養(yǎng)箱內培養(yǎng)1～2 h 使精子獲能，并調整精子濃度為3×106／mL。將各組培養(yǎng)24 h 的OCCs 用透明質酸酶去除顆粒細胞，將調整濃度后的精子移入各組成熟的卵母細胞中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)5 h。于顯微鏡下觀察卵母細胞形態(tài)，正常受精的標志為出現2個原核，計算受精率＝（受精卵個數／成熟卵個數） ×100%，24 h 后計算卵裂率＝（卵裂球個數／受精卵數） ×100%。

2.6 免疫熒光檢測VEGF-A、cdc2 蛋白表達及定位 將培養(yǎng)后的卵母細胞置于4%多聚甲醛37℃固定1 h，37℃透膜（0.5%Triton X-100） 20 min，10% BSA 封閉1 h。一抗VEGF-A（1∶300） 和cdc2（1∶200） 4℃孵育過夜，二抗37℃避光孵育1 h（1∶200），0.1% 吐溫20 清洗3 次，5 min／次。DAPI 染核，封片，熒光顯微鏡下拍照。

2.7 RT-PCR 檢測VEGF-A、cdc2 mRNA 表達 每組收集約200個培養(yǎng)后的卵母細胞，使用RNA 提取試劑盒從卵母細胞中提取總RNA，并按照逆轉錄試劑盒說明制備cDNA。PCR 反應條件為95℃、30 s；擴增95℃、5 s，60℃、30 s預變性；溶解曲線95℃、5 s，60℃、1 min；共40個循環(huán)。以GAPDH作為內參，根據2-△△ct相對定量法計算mRNA 相對表達量。

2.8 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 17.0 軟件進行分析，計量資料以（） 表示，VEGF-A、cdc2 蛋白及mRNA 表達采用方差分析；計數資料以n（%） 表示，卵母細胞成熟率、受精率比較用卡方檢驗。以P≤0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 HPLC 監(jiān)測養(yǎng)精種玉湯最佳取血時間 與空白血清比較，養(yǎng)精種玉湯血清在不同時間點藥物吸收峰增高，發(fā)現灌胃后0.5 h 達最高藥物吸收峰值，因此灌胃后0.5 h 為養(yǎng)精種玉湯最佳取血時間點。見圖1。

圖1 HPLC 監(jiān)測養(yǎng)精種玉湯小鼠血清有效吸收峰值

3.2 養(yǎng)精種玉湯對小鼠卵母細胞體外成熟的影響 養(yǎng)精種玉湯血清組與空白組、空白血清組比較，小鼠卵母細胞成熟率增加（P＜0.05，P＜0.01），養(yǎng)精種玉湯血清組與FSH組比較，卵母細胞成熟率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。說明養(yǎng)精種玉湯能提高卵母細胞的體外成熟率。見表1。

3.3 養(yǎng)精種玉湯對小鼠體外受精和受精卵發(fā)育的影響 與空白組比較，養(yǎng)精種玉湯血清組受精率增加（P＜0.05），與空白血清組比較，養(yǎng)精種玉湯血清組受精率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。表明養(yǎng)精種玉湯能提高卵母細胞受精率。見表2。

3.4 養(yǎng)精種玉湯對VEGF-A、cdc2 蛋白表達的影響 免疫熒光結果顯示，VEGF-A、cdc2 蛋白在小鼠卵母細胞GV 期與MⅡ期卵母細胞中表達，且定位于胞質中（圖2～3）。在卵母細胞MⅡ期，養(yǎng)精種玉湯血清組與空白組、空白組血清組比較，VEGF-A 蛋白表達減少，cdc2 蛋白表達增加（P＜0.01），見圖4。

表1 養(yǎng)精種玉湯血清對小鼠卵母細胞體外成熟的影響

表2 養(yǎng)精種玉湯血清對小鼠體外受精和受精卵發(fā)育的影響

圖2 VEGF-A 在卵母細胞中的定位

圖3 cdc2 在卵母細胞中的定位

3.5 養(yǎng)精種玉湯對VEGF-A、cdc2 mRNA 表達的影響 RTPCR 結果顯示，與空白組、空白血清組比較，養(yǎng)精種玉湯血清組VEGF-AmRNA 表達降低，cdc2 mRNA 表達增加（P＜0.05，P＜0.01）。見表3。

圖4 免疫熒光法檢測成熟卵母細胞中VEGF-A、cdc2 蛋白表達

表3 養(yǎng)精種玉湯血清對小鼠卵母細胞VEGF-A、 cdc2 mRNA 表達的影響（， n＝6）

表3 養(yǎng)精種玉湯血清對小鼠卵母細胞VEGF-A、 cdc2 mRNA 表達的影響（， n＝6）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與空白血清組比較，※P＜0.05，※※P＜0.01。

4 討論

中藥復方含藥血清能夠反映中藥在體內產生藥理效應的真實結果，提高中藥復方體外實驗結果的科學性、可靠性［4］。李儀奎［5］發(fā)現采血時間多集中在末次給藥后0.5～3 h。本研究，采用HPLC 對不同采血時間點的血清進行監(jiān)測分析，發(fā)現養(yǎng)精種玉湯灌胃后0.5 h 達最高藥物吸收峰值。因此，在灌胃后0.5 h 制備養(yǎng)精種玉湯血清用于卵母細胞體外培養(yǎng)。養(yǎng)精種玉湯出自《傅青主女科》［6］，是中醫(yī)經典名方，有補腎養(yǎng)血的功效，主治腎虧血虛、久不受孕。方中重用熟地填精益髓、滋陰補血，山萸肉滋養(yǎng)肝腎、填精益血，當歸、白芍養(yǎng)血調經，全方共奏滋腎養(yǎng)血、調補沖任之效。如傅氏云：“此方之用，不特補血，而純于填精，精滿則子宮易于攝精，血足則子宮易于容物，皆有子之道也［7］”。臨床研究發(fā)現，采用體外受精-胚胎移植技術治療不孕患者，口服養(yǎng)精種玉湯可改善子宮內膜的容受性，提高妊娠率［8］。此外，養(yǎng)精種玉湯對治療腎虧血虛型不孕患者有顯著療效，能明顯改善促性腺激素水平，提高受孕率，現已成為治療不孕癥的基礎方［9］。前期動物實驗研究發(fā)現，養(yǎng)精種玉湯可促進小鼠卵母細胞的發(fā)育，提高卵母細胞的成熟率、受精率［3］。

血管內皮生長因子VEGF 通常是指VEGF-A，VEGF-A對卵子發(fā)生有至關重要的作用［10］。有研究證實VEGF-A 可提高卵母細胞的質量［11］。其作用機制可能是VEGF 與受體結合產生了自分泌環(huán)，當VEGF 及其受體的轉錄物水平超過卵母細胞的需要時，VEGF 的自分泌環(huán)抑制卵母細胞和顆粒細胞中VEGF基因表達［12］。本實驗研究發(fā)現，養(yǎng)精種玉湯血清組VEGF-A 蛋白和mRNA 表達下降，提示養(yǎng)精種玉湯可能通過下調VEGF-A 蛋白和mRNA 表達促進小鼠卵母細胞的體外成熟。

cdc2 又稱細胞周期依賴性激酶1（cdk1），是調控細胞周期的一個關鍵細胞因子［13］。當小鼠卵母細胞從卵泡中釋放并在體外培養(yǎng)時，自發(fā)地恢復減數分裂。當卵母細胞發(fā)育到MI 中期，cdk1-cyclinB 活性的短暫下降導致中期退出和第一極體的擠出，然后卵母細胞直接進入第二次減數分裂的中期；此時MAPK 和Emi2 協(xié)調并抑制APC／C，從而穩(wěn)定cdk1 活性，使卵母細胞停滯在MⅡ中期［14-15］。本實驗研究發(fā)現，養(yǎng)精種玉湯血清組cdc2 蛋白和mRNA表達增加，提示養(yǎng)精種玉湯可能通過上調cdc2 蛋白和mRNA 表達促進小鼠卵母細胞的體外成熟。

綜上所述，養(yǎng)精種玉湯可能通過下調VEGF-A，上調cdc2 蛋白及mRNA 表達促進小鼠卵母細胞的體外成熟。本研究將中醫(yī)藥與輔助生殖技術相結合，可以從一個側面反應中醫(yī)調經種子理論在輔助生殖技術中的指導價值，有利于為經典名方養(yǎng)精種玉湯在臨床安全應用于助孕提供依據，拓展輔助生殖空間。