曹 歡 袁 楊 林 林 筆雪艷

（黑龍江省藥品檢驗(yàn)研究中心， 黑龍江 哈爾濱150088）

延胡索又名元胡，為罌粟科植物延胡索Corydalis yanhusuoW.T.Wang 的干燥塊莖，能活血、行氣、止痛，用于胸脅、脘腹疼痛等癥。如今其市場需求量較大，逐漸出現(xiàn)不法商販以次充好、以假冒真、牟取暴利等現(xiàn)象，其常見偽品有薯蕷珠牙、天南星等，經(jīng)金胺O 染色加工后使用，對成藥質(zhì)量及消費(fèi)者健康安全均有極大影響［1-5］。

宮炎康顆粒由當(dāng)歸、醋香附、川芎、海藻、赤芍、炮姜、紅花、鹽車前子、北敗醬、澤蘭、柴胡、延胡索12 味藥材組成［6］，具有活血化瘀、解毒消腫的功效，臨床上用于治療慢性盆腔炎［7-8］，尚無不良反應(yīng)報道。本品共2個規(guī)格，規(guī)格一每袋裝9 g（無蔗糖），規(guī)格二每袋裝9 g，對近20個生產(chǎn)企業(yè)的調(diào)研發(fā)現(xiàn)，方中延胡索均是粉碎后，原粉入藥，其他藥材則為提取后的揮發(fā)油及清膏入藥?，F(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)中，宮炎康顆粒及其他系列制劑的含有量測定指標(biāo)大多為芍藥苷［9-10］，很少涉及阿魏酸［11-12］，也尚無延胡索含有量控制的方法［13］。因此，本實(shí)驗(yàn)基于延胡索現(xiàn)狀，以及宮炎康顆粒工藝特點(diǎn)、標(biāo)準(zhǔn)缺陷等因素，對方中該藥材投料情況進(jìn)行全面質(zhì)量研究，以期為其相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的完善提供依據(jù)，保障人民用藥安全。

1 材料

1.1 儀器 DM2500 Leica 熒光顯微鏡；Linomat5 半自動點(diǎn)樣儀；Agilent 1100 液相色譜儀；Waters e2695 液相色譜儀；TW-20 水浴鍋；SK2510LHC 超聲儀。

1.2 試劑與藥物 延胡索乙素（批號110736-201438，純度99.9%）、金胺O（批號111770-200701） 對照品均購自中國食品藥品檢定研究院；宮炎康顆粒為國家評價抽驗(yàn)樣品。乙腈、甲醇為色譜純（美國霍尼韋爾公司）；磷酸為色譜純（美國Sigma 公司）；二氯甲烷（上海試一化學(xué)試劑有限公司）；三乙胺（分析純）、醋酸銨、氨水（氫氧化銨）、乙酸乙酯、甲酸均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。預(yù)制板硅膠G 板、進(jìn)口MN 板。

2 方法與結(jié)果

2.1 異性有機(jī)物 取顆粒9 g，加50 mL 水超聲30 min，放冷，濾過，濾渣中加入適量水合氯醛試液，裝片，判定視野中不得檢出除延胡索以外其他藥材植物組織特征，見圖1。

圖1 植物組織特征

2.2 TLC 鑒別及金胺O 檢查

2.2.1 TLC 鑒別（延胡索） 取顆粒（規(guī)格一） 約4.5 g或（規(guī)格二） 約9 g，研細(xì)，加5 mL 濃氨潤濕，再加30 mL三氯甲烷超聲處理40 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)? mL甲醇溶解，作為供試品溶液；取缺藥材陰性樣品，同法制備陰性樣品溶液；取對照藥材0.5 g，同法制備對照藥材溶液；取延胡索乙素對照品適量，加甲醇制成每1 mL 含0.5 mg該成分的對照品溶液。按照2015 年版《中國藥典》四部通則0502（薄層色譜法），吸取上述溶液各5 μL，點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以正己烷-氯仿-甲醇（7.5∶4∶1） 為展開劑，展開，取出，晾干，置碘蒸氣中熏至斑點(diǎn)清晰，紫外燈（365 nm） 下檢視，結(jié)果見圖2。由此可知，供試品色譜在與對照藥材、對照品相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)。

圖2 顆粒TLC 色譜圖

2.2.2 金胺O 檢查

2.2.2.1 TLC 法 取顆粒9 g，研細(xì)，加0.1%甲酸甲醇溶液50 mL，密塞，超聲處理30 min，放冷，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL 溶解，作為供試品溶液；取金胺O 對照試劑適量，加甲醇制成每1 mL 含0.3 mg 該成分的溶液，作為對照試劑溶液。按照2015 年版《中國藥典》 通則0502（薄層色譜法），取供試品溶液5 μL、對照試劑溶液2 μL，點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-氨水（4∶5∶1∶1） 下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，日光下檢視，結(jié)果見圖3。按規(guī)定，供試品色譜在與對照試劑相應(yīng)位置上不得顯示相同顏色的斑點(diǎn)，若出現(xiàn)，則采用HPLC 法驗(yàn)證。

圖3 顆粒金胺O 檢查結(jié)果（預(yù)制板）

2.2.2.2 HPLC 法 按照2015 年版《中國藥典》 0512（高效液相色譜法） 測定。

色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相甲醇（A） -0.05 mol／L 醋酸銨（B），梯度洗脫，程序見表1；檢測波長為432 nm。理論塔板數(shù)按金胺O 對照試劑色譜中的主峰計(jì)算，應(yīng)不低于2 000。

表1 梯度洗脫程序

對照試劑溶液制備：取金胺O 對照試劑適量，加甲醇制成每1 mL 含8 μg 該成分的溶液，即得。供試品溶液制備：取“2.2.2.1” 項(xiàng)下的供試品溶液，上清液用0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

取對照試劑、供試品溶液各10 μL，在上述色譜條件下進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖4。按規(guī)定，供試品色譜在與金胺O對照試劑保留時間相應(yīng)位置不得出現(xiàn)相同色譜峰，若出現(xiàn)，則采用二極管陣列檢測器比較其在320～450 nm 波長范圍的紫外-可見吸收光譜，而且應(yīng)不相同。

圖4 金胺O HPLC 色譜圖

檢測限：取金胺 O 對照試劑適 量，配制成1.566 μg／mL，在上述色譜條件下進(jìn)樣1 μL 測定，測得信噪比為12.7（主峰），儀器檢出限（進(jìn)樣量×3／信噪比） 為0.37 ng，方法檢出限［儀器檢出限×樣品稀釋倍數(shù)／（樣品取樣量×樣品進(jìn)樣體積）］為8.2 mg／kg；耐用性：采用Kromasil、Thermo C18、Ultimate LP-C18十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱，取供試品、對照試劑溶液，上述色譜條件下進(jìn)樣測定，發(fā)現(xiàn)色譜峰分離度、理論塔板數(shù)均滿足要求，耐用性良好。

2.3 含有量測定

2.3.1 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) Agilent TC-C18（2）色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈-0.1%磷酸（三乙胺調(diào)pH 值至6.0）（40∶60）；體積流量1.0 mL／min；柱溫30℃；檢測波長280 nm，理論塔板數(shù)按延胡索乙素峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。精密取供試品溶液20 μL、對照試劑溶液10～20 μL，在上述色譜條件下進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖5。由此可知，供試品色譜圖在與對照品相應(yīng)位置上有相同保留時間的色譜峰，陰性無干擾。

2.3.2 對照品溶液制備 精密稱取延胡索乙素對照品適量，甲醇制成每1 mL 含50 μg 該成分的溶液，即得。

圖5 延胡索乙素HPLC 色譜圖

2.3.3 供試品溶液制備 取顆粒（規(guī)格一） 約4.5 g 或（規(guī)格二） 約9 g，精密稱定，置于錐形瓶中，精密加入濃氨試液-甲醇（1∶20） 混合溶液50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流1 h，放冷，濃氨試液-甲醇（1∶20） 混合溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液25 mL，蒸至近干，50%甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL 量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.4 線性關(guān)系考察 精密稱取延胡索乙素對照品適量，加甲醇分別制成每 1 mL 含 1.163、5.814、11.628、29.071、116.284 μg 該成分的溶液，在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣20 μL 測定。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸，得方程為Y＝18.119 5X＋3.561 2（r＝1.000 0），在23.26～2 325.68 ng 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.5 精密度試驗(yàn) 取對照品溶液適量，在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定5 次，測得延胡索乙素峰面積RSD 為0.1%，表明儀器精密度良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液（企業(yè)2，批號150326），于0、2、6、10、16 h 在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣20 μL 測定，測得延胡索乙素含有量RSD 為1.8%，表明溶液在16 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批顆粒6 份，按“2.3.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得延胡索乙素含有量RSD 為2.9%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取延胡索乙素含有量已知（0.051 mg／g） 的顆粒（企業(yè)2，批號150326） 9 份，每份約4.5 g，精密加入已知量對照品溶液，按“2.3.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在 “2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣20 μL測定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表2。

2.3.9 耐用性試驗(yàn) 采用不同儀器（Agilent 1100、Waters e2695）、色譜柱［Agilent TC-C18（2）、WelchUltimate LP-C18、Kromasil 100-5C18］，取供試品、對照試劑溶 液，在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。結(jié)果，色譜峰分離度、理論塔板數(shù)均能滿足要求，表明該方法耐用性良好。

表2 延胡索乙素加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）

2.3.10 樣品含有量測定 精密吸取供試品溶液20 μL，在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算含有量，結(jié)果見表3。

表3 延胡索乙素含有量測定結(jié)果

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用異性有機(jī)物檢查法對7個企業(yè)宮炎康顆粒進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)企業(yè)4、6 檢出草酸鈣針晶，不屬于方中任一藥味，可能為延胡索常見偽品薯蕷珠牙，表明上述企業(yè)可能存在摻偽投料情況；采用TLC、HPLC 法，發(fā)現(xiàn)企業(yè)4檢出金胺O 斑點(diǎn)及色譜峰，進(jìn)一步印證了該現(xiàn)象。

現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)及文獻(xiàn)中有3 種延胡索鑒別方法，提取方法分別為（1） 濃氨濕潤，氯仿提??；（2） 甲醇提取后溶液蒸干，殘?jiān)苷{(diào)堿性后乙醚提?。?4］；（3） 甲醇提取后溶液蒸干，殘?jiān)?%醋酸溶解，調(diào)堿性后乙醚提取，發(fā)現(xiàn)方法（1） 操作簡便，提取充分，延胡索藥材及延胡索乙素?zé)晒獍唿c(diǎn)較強(qiáng)，而展開方法分別為正己烷-氯仿-甲醇（7.5∶4∶1）、正己烷-氯仿-乙酸乙酯-丙酮（8∶1∶2∶1）、正己烷-乙酸乙酯-氨水（6∶4∶0.2），發(fā)現(xiàn)正己烷-氯仿-甲醇（7.5∶4∶1） 展開時，樣品與對照藥材對應(yīng)熒光斑點(diǎn)更多，Rf值適宜，分離效果較好，陰性無干擾。

延胡索為原粉入藥，占整個處方的6.7%。2015 年版《中國藥典》 一部［15］規(guī)定，延胡索乙素含有量不低于0.050%，按該限度折算后宮炎康顆粒中其應(yīng)不低于0.034 mg／g，結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)可能由于粉碎、運(yùn)輸、加工等造成的損失，按50%轉(zhuǎn)移率規(guī)定含有量限度為每1 g 含延胡索以延胡索乙素（C21H25NO4） 計(jì)不得少于0.017 mg，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)10 批樣品中其最低值0.001 mg／g，最高值0.085 mg／g，低于限度的共有4 批。由此可知，不同企業(yè)生產(chǎn)的宮炎康顆粒中延胡索質(zhì)量存在較大差異，部分可能存在少投料情況。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)結(jié)果均反映宮炎康顆粒中延胡索的質(zhì)量，可全面控制其是否摻偽，定性定量控制其是否存在投料不實(shí)、藥材質(zhì)量差等情況，通過綜合手段保證用藥安全，也可為后續(xù)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立奠定基礎(chǔ)。