張昊 劉慧娟 李荷香 宋鵬 劉旭倩 侯亞麗

口腔黏膜良性淋巴組織增生病(benign lymphoadenosis of oral mucosa, BLOM)是一種臨床上并不少的口腔黏膜病。課題組前期調(diào)查[1]發(fā)現(xiàn)64.3%BLOM表現(xiàn)為黏膜糜爛潰瘍、26.5%為白紋或白斑、 9.2%為結(jié)節(jié)狀突起、臨床誤診率高達98%。由于誤診率高，多年來人們忽視了BLOM[2]，其發(fā)病機制更是少有研究。肥大細胞(mast cell, MC)[3]是一種重要的免疫細胞，它參與了機體多種生理和病理過程如過敏反應(yīng)、慢性炎癥、腫瘤等。研究證實MC在口腔扁平苔蘚[4]、白斑[5]、口腔黏膜下纖維性變等組織中[6]都發(fā)現(xiàn)有數(shù)目的增多，提示MC在口腔黏膜病的發(fā)生中發(fā)揮了重要作用。BLOM與MC關(guān)系的研究至今少有報道。本研究采用甲苯胺藍組織化學(xué)染色和類胰蛋白酶抗體免疫組織化染色觀察BLOM中MC分布、數(shù)量及脫顆粒情況，探討MC在BLOM中表達及其與臨床病理的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對象

30 例BLOM蠟塊均來自河北醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院病理科作為BLOM組。15 例正常黏膜組織取自腫瘤周圍正常黏膜作為正常對照組。 30 例BLOM患者均無移植宿主疾病、丙型肝炎或艾滋病毒感染；活檢前近6 個月均沒有接受過局部或全身治療。

30 例BLOM中，男性10 例(33.33%)，平均年齡(57.3±16.5) 歲， 女性20 例(66.67%)， 平均年齡(52.6±11.9) 歲。病程0.5～240 個月不等， 平均病程(26.5±47.4) 個月，中位病程12 個月。 15 例正常黏膜組織取自腫瘤周圍正常黏膜作為正常對照組。其中男性7 例(46.67%)， 平均年齡(58.9±10.3) 歲、女性8 例(53.33%)，平均年齡(56.4±8.4) 歲。

1.2 試劑

甲苯胺藍染色試劑盒(北京雷根生物技術(shù)有限公司); 肥大細胞類胰蛋白酶單克隆抗體(Abcam公司, 英國); PV-9000免疫組化試劑盒、DAB 顯色試劑盒(北京中杉金橋)。

1.3 實驗方法

1.3.1 甲苯胺藍染色法 將組織蠟塊分別切成厚度為3～4 μm的切片，常規(guī)脫蠟至水，入甲苯胺藍液中染色20 min， 95%酒精分色，鏡下控制，無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.3.2 免疫組織化學(xué)染色法 將組織蠟塊分別切成厚度為3～4 μm的切片，脫蠟至水， 0.01 mol/L PBS沖洗5 min×3 次，放入枸櫞酸緩沖液中熱修復(fù)，一抗類胰蛋白酶抗體滴度為1∶1 000， 以后按PV9000試劑盒說明書操作，蘇木素復(fù)染，無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。陽性對照采用已知的陽性組織切片，空白對照用PBS代替一抗。

1.3.3 結(jié)果判讀 甲苯胺藍染色中MC計數(shù)標準參照潘倩如[7]的方法，分別將BLOM組和正常對照組每張切片在高倍視野(×400) 下選取MC數(shù)目最多的5 個視野進行計數(shù)，計算5 個視野MC總數(shù)和脫顆粒率平均值。脫顆粒率=(脫顆粒MC數(shù)/MC總數(shù))×100%。MC判定：甲苯胺藍染色細胞核為藍色，胞核不明顯，胞漿紫紅色，細胞周圍無紫紅色顆粒溢出者為MC；免疫組織化學(xué)染色類胰蛋白酶陽性信號為胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒。甲苯胺藍染色脫顆粒MC判定：細胞核清晰或破裂、胞漿顆粒清晰，周圍組織中存在紫紅色顆粒者為脫顆粒MC。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 甲苯胺藍染色結(jié)果

①甲苯胺藍染色MC總數(shù)在BLOM組(圖 1)和正常對照組的表達(圖 1, 表 1)： MC總數(shù)在BLOM組明顯增多，彌漫分布于黏膜固有層淋巴細胞之間、淋巴濾泡周圍或血管周圍；其形態(tài)為圓形或橢圓形，細胞核藍色居中或偏位，胞漿紫紅色或含有大小不一的紫紅色顆粒。正常對照組MC總數(shù)較少，分布于黏膜上皮下，但其體積較BLOM各組明顯縮小。 BLOM組MC數(shù)目較正常對照組升高(P<0.05); ②BLOM組和正常對照組甲苯胺藍染色MC脫顆粒率(表 2) BLOM組甲苯胺藍染色MC均發(fā)生了不同程度地脫顆粒：MC破碎，核膜不清晰，周圍可見大量紫紅色顆粒(圖 2, 箭頭示)。 BLOM組MC脫顆粒率較正常對照組明顯升高(P<0.05)。

2.2 免疫組化染色結(jié)果(表 3)

類胰蛋白酶抗體免疫組織化學(xué)染色MC總數(shù)在BLOM組和正常對照組均有明顯表達(圖 3)， 但BLOM組更密集， 更明顯， 陽性細胞廣泛分布于黏膜固有層淋巴細胞之間、淋巴濾泡周圍及血管周圍。個別BLOM在黏膜上皮基底細胞層也可以看到散在陽性細胞。正常對照組陽性細胞多位于黏膜上皮下。BLOM組MC總數(shù)較正常對照組明顯升高(P<0.05)。

圖1 2 組組織中的MC的表達(甲苯胺藍染色, ×400) 圖 2 2 組組織中的脫顆粒MC(甲苯胺藍染色， ×1 000)

Fig 1 MC(arrow) expression of the 2 groups (Toluidine blue staining, ×400) Fig 2 Degranulation of MC (arrow) of the 2 groups (Toluidine blue staining, ×1 000)

表 1 甲苯胺藍染色檢測MC總數(shù)

表 2 甲苯胺藍染色MC脫顆粒率

2.3 MC總數(shù)與BLOM臨床病理的關(guān)系(表 4)

甲苯胺藍染色和類胰蛋白酶抗體免疫組織化學(xué)染色MC總數(shù)在非糜爛型、腫物型和糜爛型BLOM中依次升高(P<0.05)，但甲苯胺藍染色MC總數(shù)在BLOM各臨床分型間差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而類胰蛋白酶抗體免疫組織化學(xué)染色MC總數(shù)在各臨床分型間差異則有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 兩兩比較，免疫組織化學(xué)染色MC總數(shù)差異僅在非糜爛型和糜爛型BLOM間有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.017)，而非糜爛型和腫物型BLOM、糜爛型和腫物型BLOM之間MC總數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.017)。 2 種染色MC總數(shù)與BLOM年齡、性別、部位、病程及炎癥輕重程度和黏膜固有層淋巴濾泡的形成無明顯相關(guān)性(P>0.05)。

圖3 2 組組織中的MC(箭頭示) (IHC， ×400)

Fig 3 MC(arrow) in the tissue of the 2 groups

(IHC, ×400)

表 4 MC總數(shù)與BLOM臨床病理的關(guān)系

注： ①非糜爛型與糜爛型相比，P<0.017

2.4 MC脫顆粒率與BLOM臨床病理的關(guān)系(表 5)

MC脫顆粒率在非糜爛型、糜爛型和腫物型BLOM中依次升高(P<0.05)。但兩兩比較，MC脫顆粒率僅在非糜型和糜爛型BLOM、非糜爛型和腫物型BLOM有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.017)。MC脫顆粒率與BLOM年齡、性別、部位、病程及炎癥輕重程度及和黏膜固有層淋巴濾泡的形成無明顯相關(guān)性(P>0.05)。

表 5 甲苯胺藍染色MC脫顆粒率與BLOM臨床病理的關(guān)系

注： ①非糜爛型與糜爛型相比，P<0.017

3 討 論

MC來源于骨髓造血干細胞，離開骨髓后隨血液循環(huán)遷移至與外界相通的組織和器官發(fā)育成熟，成為抵御病原體入侵的一個重要免疫細胞[8]。其胞漿常包含80～300 個嗜堿性顆粒，而且這些顆粒具有易染性，在HE染色下不易分辨，但在甲苯胺藍染色下呈現(xiàn)紫紅色。人類MC均含有類胰蛋白酶，它是MC的一個特異蛋白酶。 故本研究采用甲苯胺藍組織化學(xué)染色和類胰蛋白酶免疫組織化學(xué)染色觀察MC。

BLOM以淋巴濾泡形成或淋巴細胞灶狀聚集為病理特征，孫開華等[9]認為它是某種刺激引起的反應(yīng)性增生性疾病。課題組前期調(diào)查發(fā)現(xiàn)43.9%BLOM上皮內(nèi)均可見到不同程度的病毒感染，提示病毒可能是刺激因素之一。病毒或病毒代謝產(chǎn)物可能激活存在于黏膜組織中的少量MC，使其分泌TNF-α或其它炎癥介質(zhì)，募集中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和其它炎癥細胞到病變部位[10]。課題組前期對BLOM臨床病理調(diào)查發(fā)現(xiàn)： 51%BLOM上皮有中性粒細胞浸潤， 41.8% BLOM 黏膜固有層有不同程度嗜酸性粒細胞浸潤、所有BLOM固有層均有淋巴細胞和漿細胞浸潤[1]。MC不僅能加強對病毒的清除，它也可能成為其共同聚集、復(fù)制和逃避免疫的場所[10]，使病毒存活并不斷復(fù)制，刺激黏膜組織導(dǎo)致黏膜固有層淋巴濾泡的形成，發(fā)生BLOM。本研究中甲苯胺藍組織化學(xué)染色和類胰蛋白酶抗體免疫組織化學(xué)染色均顯示BLOM組中MC總數(shù)較正常對照組明顯增高，與平昭[11]研究結(jié)果相同。這提示MC在BLOM發(fā)生中發(fā)揮了重要作用。但是，對于MC增殖機制至今尚不清楚。劉雪梅[12]認為MC在腫瘤、炎癥等部位的聚集是通過MC或其前體細胞的移動來實現(xiàn)。莊玉等[13]認為MC增殖在一定程度上依賴于T淋巴細胞，部分MC是由于T淋巴細胞受到刺激后轉(zhuǎn)化而來。

本研究結(jié)果顯示：無論是甲苯胺藍染色還是類胰蛋白酶抗體免疫組織化學(xué)染色，BLOM組MC總數(shù)都明顯高于正常對照組(P<0.05)。但是兩種染色MC總數(shù)在BLOM各臨床分型間卻出現(xiàn)了不同結(jié)果：甲苯胺藍染色MC總數(shù)在臨床各分型間無差異，而免疫組織化學(xué)染色卻有顯著性差異。這可能是由于甲苯胺藍染色時需要95%乙醇分化，其分化程度不同可能影響其染色結(jié)果，從而影響MC計數(shù)。而免疫組織化學(xué)染色較為敏感，導(dǎo)致了兩種染色結(jié)果的不同。本研究認為用免疫組織化學(xué)方法觀察MC總數(shù)更為敏感和特異，與Dinakar等[14]意見一致。BLOM組各臨床分型間兩兩比較，免疫組織化學(xué)染色MC總數(shù)僅在糜爛型和非糜爛型BLOM間有差異，而兩者和腫物型BLOM相比較均無差異。推測這可能是由于糜爛型、非糜爛型BLOM與腫物型BLOM病理變化不同造成。腫物型BLOM和其它兩型病理變化不同：腫物型BLOM病理變化似纖維上皮息肉或鱗狀細胞乳頭狀瘤，固有層除淋巴濾泡形成外，還有大量纖維結(jié)締組織增生。而糜爛型和非糜爛型BLOM病理變化相似，是一種慢性炎癥的改變。這提示腫物型BLOM和糜爛型、非糜爛型BLOM發(fā)生機制可能不同。

MC胞漿中的顆粒包含大量貯存各種炎癥的介質(zhì)。某種抗原刺激機體后，機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生IgE抗體，抗原抗體結(jié)合激活MC，使其脫顆粒釋放炎癥介質(zhì)和多種細胞因子如：蛋白水解酶(類胰糜蛋白酶、胃促胰酶、肥大細胞羧基肽酶)、組胺、肝素、硫酸軟骨素E和堿性成纖維細胞生長因子、腫瘤壞死因子等降解結(jié)締組織基質(zhì)[15]，對周圍組織造成損傷并且促進淋巴細胞的浸潤，加重炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示：BLOM組MC脫顆粒率較正常對照組明顯升高，提示某種刺激導(dǎo)致的MC脫顆?？赡軈⑴c了BLOM的發(fā)生。推測BLOM復(fù)雜多樣的臨床表現(xiàn)可能和MC脫顆粒時釋放不同的細胞因子有關(guān)。BLOM臨床主要表現(xiàn)為糜爛，潰瘍?？赡苁怯捎贛C釋放了類胰糜蛋白酶，破壞上皮基底膜處的層黏連蛋白和Ⅳ型膠原蛋白[16]導(dǎo)致潰瘍形成，發(fā)生糜爛型BLOM。類胰蛋白酶還能刺激成纖維細胞不斷增殖[17]，促進膠原纖維增生。MC脫顆粒釋放的肝素能夠促進膠原成熟，從而形成腫物型BLOM。本研究發(fā)現(xiàn)MC脫顆粒率在非糜爛型、糜爛型和腫物型BLOM中依次升高，是否提示非糜爛型、糜爛型和腫物型BLOM可能是其3 個不同的發(fā)展階段，有待于進一步研究。 研究結(jié)果還顯示2 種染色MC總數(shù)和免疫組織化學(xué)染色MC脫顆粒率均與BLOM年齡、性別、部位、病程、炎癥輕重程度及黏膜固有層淋巴濾泡的形成無明顯相關(guān)性，推測BLOM的發(fā)生發(fā)展是一個多因素參與的復(fù)雜過程。

綜上所述，BLOM的發(fā)生發(fā)展是一個復(fù)雜的過程，其中MC和BLOM密切相關(guān)，其增殖和脫顆?？赡茉贐LOM發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。