李煒星 歐陽林娟 王 薇 陳小榮 彭小松 賀浩華 孫曉棠 朱昌蘭

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)作物生理生態(tài)與遺傳育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌 330045)

稻米是我國三分之二以上人口的主食，其質(zhì)量安全直接關(guān)系到人民健康。近年來，工業(yè)“三廢”排放、污水灌溉、含鎘投入品使用、土壤酸化促進(jìn)有效鎘轉(zhuǎn)化等，導(dǎo)致部分農(nóng)田鎘含量超標(biāo)。鎘污染不僅影響水稻生長發(fā)育，使產(chǎn)量下降，更嚴(yán)重的是會導(dǎo)致鎘在稻米中超標(biāo)累積，危及稻米安全。鎘被世界衛(wèi)生組織劃為一級致癌物質(zhì)，在人體內(nèi)的半衰期為10～30年，長期食用鎘超標(biāo)食品將導(dǎo)致慢性中毒，引發(fā)骨質(zhì)疏松、腎功能衰竭、癌癥及心血管疾病等。近年來，稻米鎘含量超標(biāo)現(xiàn)象在我國時(shí)常發(fā)生，已成為影響人類健康的重大安全問題。利用作物本身對鎘積累的差異，選育籽粒低積累的水稻品種，是防控治理稻米鎘污染問題最直接和經(jīng)濟(jì)有效的途徑。本文從不同基因型水稻籽粒鎘積累差異、稻米中鎘的分布及存在形態(tài)等方面綜述了稻米鎘積累特性，并從鎘積累相關(guān)基因及數(shù)量性狀基因座(quantitative trait locus；QTL)的鑒定與功能分析等方面綜述了稻米鎘積累遺傳調(diào)控研究進(jìn)展，對稻米鎘積累的研究前景進(jìn)行了展望，旨在為降低稻米鎘含量、減少食品安全問題提供借鑒。

1 稻米鎘積累特性

許多研究表明，鎘在稻米中的積累存在顯著的基因型差異，這為通過遺傳改良降低稻米鎘含量提供了可能。多數(shù)研究結(jié)果認(rèn)為，秈稻吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)鎘的能力大于粳稻[1-5]。有研究發(fā)現(xiàn)，雜交稻比常規(guī)稻更容易吸收和富集鎘[6]，與普通雜交稻相比，超級雜交稻籽粒的Cd含量較高，鋅含量較低[7]。也有研究認(rèn)為雜交秈稻與常規(guī)秈稻品種相比，籽粒對鎘的累積能力不存在明顯差異，不能按水稻類型來篩選鎘低積累品種[8,9]。由于晚稻生長季節(jié)根際土壤鎘含量顯著高于早稻生長季節(jié)，晚稻的稻米鎘超標(biāo)情況往往較早稻更為嚴(yán)重[10]。

鎘在稻谷中的分布不均勻，主要分布在水稻的胚、糊粉層和外層胚乳中，胚乳中分布較少[11]。水稻各部分鎘含量由高到低為皮層>胚>胚乳>穎殼[12]，也有認(rèn)為穎殼的鎘含量高于胚乳，胚乳中的鎘含量最低[13]。因此，稻谷經(jīng)加工后，米糠中富集了很大一部分鎘，其鎘濃度可比精米高5倍以上[2]。雖然米糠只占稻谷總質(zhì)量的9%，精米占稻谷總質(zhì)量的70%，但米糠中富集的鎘元素約占整個(gè)稻谷籽粒鎘元素的40%。

鎘在稻米中主要以蛋白結(jié)合態(tài)形式存在，占水稻籽粒鎘總量53.4%，淀粉結(jié)合態(tài)占12.3%，其他形態(tài)占34.3%[11]。不同蛋白組分的鎘結(jié)合能力表現(xiàn)為球蛋白鎘濃度最高，清蛋白次之，醇溶性蛋白和谷蛋白鎘濃度則相對較低，但球蛋白和谷蛋白中鎘的總含量處于遙遙領(lǐng)先的地位[11]。清蛋白和球蛋白主要集中在米糠中，谷蛋白主要分布在胚乳中，醇溶性蛋白的分布比較均勻，不同部位含量差異不明顯[11]。發(fā)現(xiàn)鎘主要與54.5 ku和5.5 ku分子質(zhì)量的蛋白結(jié)合，富鎘蛋白中谷氨酸、纈氨酸、半胱氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸的相對含量較高[14]。研究表明含硫氨基酸殘基可能是蛋白質(zhì)與鎘結(jié)合的位點(diǎn)[11]。

2 稻米鎘積累相關(guān)基因及其功能

鎘在稻米中的積累主要是通過根系對鎘的吸收，經(jīng)過木質(zhì)部的裝載和運(yùn)輸轉(zhuǎn)移到地上部，再經(jīng)過韌皮部的運(yùn)輸和轉(zhuǎn)移積累到籽粒中?，F(xiàn)有研究表明，自然抗性巨噬細(xì)胞蛋白(natural resistance-associated macrophage protein，NRAMP)、重金屬 ATP 酶(heavy metal ATPase, HMA)、鋅鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ZIP)家族等一些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因參與了水稻對鎘的吸收和積累(表1)。

表1 已鑒定的稻米鎘積累相關(guān)基因

2.1 鋅鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因

Pence等[15]首先發(fā)現(xiàn)鎘離子可以通過水稻鋅鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在水稻體內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)。Nakanishi等和Lee等分別報(bào)道了Zn2+和 Fe2+的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白OsIRT、OslRT2對 Cd2+也具有較高的親和性，在缺鐵處理下能增強(qiáng)水稻對 Cd2+的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)[16,17]。

2.2 NRAMP家族基因

NRAMP是一類具有二價(jià)金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)功能的蛋白，能夠轉(zhuǎn)運(yùn)Mn2+、Zn2+、Cu2+、Fe2+、Cd2+、Ni2+、Co2+和Al3+。水稻基因組中有7個(gè)OsNRAMP，其中OsNramp5和OsNramp1 已被證實(shí)參與了調(diào)控Cd的吸收與運(yùn)輸。OsNramp5能夠調(diào)控Mn2+、Fe2+和Cd2+等穿過凱氏帶進(jìn)入木質(zhì)部維管束[18]，缺失OsNramp5在降低鎘積累的同時(shí)，也顯著降低水稻生長和籽粒產(chǎn)量[19,20]。

與OsNramp5相比，OsNramp1基因的作用很小。OsNramp1蛋白參與鎘、鐵的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)[21]。OsNramp1主要在水稻根部表達(dá)，參與中柱和木質(zhì)部中鎘的裝載轉(zhuǎn)運(yùn)。研究發(fā)現(xiàn)，OsNramp1在水稻品種Sasanishiki和Habataki的根系中表達(dá)水平差異明顯，導(dǎo)致2個(gè)品種鎘積累量差異顯著[21]。有研究發(fā)現(xiàn)OsNramp1在粳稻中的表達(dá)水平明顯低于秈稻[22]。

2.3 重金屬 ATP 酶(HMA)基因

HMA是一種重金屬離子跨膜蛋白，通過 ATP 水解提供的能量實(shí)現(xiàn)重金屬離子在細(xì)胞膜上的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。水稻全基因組中有9個(gè)編碼HMA的基因(OsHMA1～OsHMA9)，其中OsHMA1～OsHMA3屬于 Zn/Co/Cd/Pb二價(jià)陽離子結(jié)合型，其余 6個(gè)屬于 Cu/Ag 單價(jià)陽離子結(jié)合型[23]。Ueno等[24,25]和Miyadate等[26]團(tuán)隊(duì)分別通過圖位克隆技術(shù)分離到位于第7染色體上的單隱性基因OsHMA3，這是水稻中迄今為止唯一一個(gè)通過正向遺傳學(xué)手段克隆得到的Cd 相關(guān)基因。OsHMA3可以將由根吸收到的Cd2+封存在根部細(xì)胞的液泡中，從而降低由木質(zhì)部向地上部運(yùn)輸?shù)腃d2+量，導(dǎo)致籽粒的Cd積累減少[26,27]。過表達(dá)OsHMA3能顯著降低Cd在水稻籽粒中的積累，而不影響Zn、Fe等其他金屬離子的運(yùn)輸和積累。也有研究發(fā)現(xiàn)OsHMA3過表達(dá)還能提高根部中的鋅濃度，上調(diào)莖稈中部分鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)量[28]。在高Cd積累的秈稻品種中發(fā)現(xiàn)了OsHMA3的等位突變[25,29]，在粳稻中也發(fā)現(xiàn)了OsHMA3的等位突變，無論盆栽還是大田試驗(yàn)下，突變粳稻品種中籽粒的Cd 含量均顯著高于普通粳稻品種[30]。

OsHMA2是OsHMA3的一個(gè)同源基因，主要在根系中表達(dá)，在莖節(jié)中有少量表達(dá)。與OsHMA3不同的是，OsHMA2 是一個(gè)外轉(zhuǎn)運(yùn)子，OsHMA2的過表達(dá)能加速鎘、鋅等金屬離子向木質(zhì)部的裝載及其從地下部向地上部的轉(zhuǎn)運(yùn)，增加葉片中鎘和鋅的含量。與野生型相比，過表達(dá)OsHMA2能使籽粒Cd含量降低一半，而對Zn等其他元素含量沒有影響；抑制OsHMA2表達(dá)則能降低葉片中的Cd、Zn 含量，提高根系中的Zn含量[23,31]。

OsHMA9主要在葉肉細(xì)胞和花藥中表達(dá)，雖然屬于Cu/Ag亞群，負(fù)責(zé)細(xì)胞中Cu、Zn、Pb的向外轉(zhuǎn)運(yùn)，但也與木質(zhì)部Cd 的裝載有關(guān)，可能是鎘的另一個(gè)外轉(zhuǎn)運(yùn)子，參與細(xì)胞內(nèi)鎘等金屬離子的向外轉(zhuǎn)運(yùn)[32,33]。高濃度的Cd可誘導(dǎo)OsHMA9在維管束中大量表達(dá)，OsHMA9缺失突變體中Cd積累量大大提高[34]。

2.4 其他轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因

OsLCT1是鎘低親和性陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(Low-affinity cationtransporter，LCT)，是一個(gè)韌皮部轉(zhuǎn)運(yùn)子，主要在水稻灌漿過程中將鎘從莖節(jié)經(jīng)韌皮部轉(zhuǎn)運(yùn)到籽粒中[35]。OsPDR9是一個(gè)ATP-結(jié)合框蛋白(ATP-binding cassette, ABC)基因，受Cd誘導(dǎo)在水稻幼苗根系大量表達(dá)，可能影響水稻根系中Cd的積累[36]。OsMTP1和QZT1同為金屬耐受蛋白(metal tolerance protein, MTP)基因，編碼陽離子擴(kuò)散促進(jìn)因子蛋白，通過高效轉(zhuǎn)運(yùn)Cd、Zn和其他重金屬元素，維持植物體內(nèi)陽離子的平衡，受 Cd2+、Zn2+、Mg2+、Cu2+和 Fe2+等重金屬離子誘導(dǎo)[37]。低鎘基因(low cadmium, LCD)在根維管束和葉片韌皮部伴胞中高表達(dá)，與野生型相比，突變體葉片的Cd 含量沒有差異，谷粒的Cd含量減少了約50%，表明突變體運(yùn)輸和積累鎘的能力降低，推測OsLCD可能是參與調(diào)控韌皮部中Cd 轉(zhuǎn)運(yùn)的基因[38]。鎘抗性相關(guān)蛋白基因(plant cadmium resistance 1, PCR1)主要表達(dá)部位為幼苗期的根和生殖期的第Ⅰ節(jié)、第Ⅱ節(jié)間，在水稻穗中檢測有一定表達(dá)量；OsPCR1敲除株系的籽粒表現(xiàn)出鎘含量降低，但同時(shí)伴隨著粒重下降和粒長變短的不良變化[39]。OsCCX2是一個(gè)在莖節(jié)表達(dá)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，可能是一個(gè)陽離子/鈣(Ca)交換器，負(fù)責(zé)Cd加載到木質(zhì)部導(dǎo)管中，從而介導(dǎo)鎘在水稻籽粒中的積累[40]。CAL1功能缺失的突變體中水稻葉片中的鎘濃度顯著降低[41]，其他轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因還有OsAUX1、OsMAPK2、OsNAAT1、PEZ1、RCS1、OsCDT1-OsCDT5、OsMSRMK2、OsMSRMK3、MxIRT1、Os-ZTP6、OsFRDL1等[42-50]。

3 稻米鎘積累相關(guān)QTL分析

Ishikawa 等[56]首次報(bào)道利用越光和Kasalath的CSSL群體在3、6、8 號染色體上定位到3 個(gè)控制糙米Cd 含量QTL，隨后國內(nèi)外學(xué)者利用各種遺傳分離群體，通過連鎖分析和全基因組關(guān)聯(lián)分析，定位到了至少100余個(gè)稻米鎘積累相關(guān)QTL，分布在水稻的12條染色體上(表2)[24,29,57-71]。

表2 稻米鎘積累相關(guān)QTL

續(xù)表2

注: 重復(fù)定位的QTL未列入。*已經(jīng)克隆;#平均值。

總體來看，除了在第7染色體短臂上檢測到一個(gè)貢獻(xiàn)率較大的QTL外，檢測到的QTL效應(yīng)均較小，貢獻(xiàn)率基本在20%以下。雖然有多個(gè)QTL被不同學(xué)者定位在了相同的區(qū)域，但在不同群體和試驗(yàn)中重復(fù)定位到的QTL總體較少。目前已進(jìn)行精細(xì)定位的QTL只有4個(gè)[24,29,50,51,61]，通過進(jìn)一步圖位克隆并得到鑒定的QTL僅有3個(gè)。Ueno等[24]、Tezuka等[29]分別利用低鎘品種和高鎘品種的F2群體，均在第7染色體短臂上定位到一個(gè)效應(yīng)很大的QTL，控制根部Cd向莖轉(zhuǎn)移率，經(jīng)過進(jìn)一步精細(xì)定位，克隆了該QTL，驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)與OsHMA3為同一個(gè)基因。LUO等[41]利用TN1和CJ06構(gòu)建的雙單倍體群體進(jìn)行QTL定位分析, 克隆到1個(gè)特異調(diào)控鎘在水稻葉片中積累的主效QTL基因CAL1。

4 展望

鎘是一種嚴(yán)重危害人體健康的重金屬元素。在分子水平上，研究者們已經(jīng)鑒定出一些金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因參與調(diào)控水稻對鎘的吸收和積累，如NRAMP1、NRAMP5、HMA2、HMA3等，研究者通過遺傳改良調(diào)控這些基因的表達(dá)，阻斷鎘的吸收、運(yùn)轉(zhuǎn)，獲得了鎘吸收和積累明顯降低的水稻材料。如Ishikawa等[19]通過輻射獲得OsNramp5缺陷突變體，大幅度降低了根部對 Cd2+的吸收，使得稻米鎘含量降低到了安全閾值。借助蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因OsSUT1啟動(dòng)子調(diào)控OsHMA2特異表達(dá)使種子中的鎘含量降低到野生型的一半[23]。湖南雜交水稻研究中心通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)定點(diǎn)突變OsRAMP5基因，培育出“低鎘1號”等低鎘水稻品種。但是，由于這些金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的底物廣泛，能夠同時(shí)運(yùn)輸多種必需營養(yǎng)元素(如Mn，F(xiàn)e 和Zn)，通過調(diào)控這些基因的表達(dá)，在降低水稻對Cd 吸收和積累的同時(shí)，也可能對必需礦質(zhì)營養(yǎng)元素的吸收和積累產(chǎn)生影響。因此，在利用這類基因時(shí)，如何避免其降低稻米營養(yǎng)品質(zhì)所產(chǎn)生的負(fù)效應(yīng)是必須要考慮的問題。

目前關(guān)于水稻Cd吸收和積累的QTL定位研究有不少，但通過QTL定位并最終克隆鑒定的基因只有OsHMA3一個(gè)，精細(xì)定位的QTL也極少，究其原因可能是水稻對Cd的吸收和積累的遺傳比較復(fù)雜，作為多基因控制的數(shù)量性狀，QTL的效應(yīng)值較小，不容易鑒別，且QTL的表型效應(yīng)受環(huán)境影響大。利用染色體片段置換系或近等基因系，減少遺傳背景干擾，盡量使QTL解離為單個(gè)孟德爾因子，將有助于QTL的精細(xì)定位和圖位克隆。此外，利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等多組學(xué)結(jié)合的方法，通過高通量技術(shù)快速分離更多的鎘脅迫響應(yīng)基因，更加深入地解析其遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，探究其在水稻生長過程中的作用，從而為降低稻米鎘含量、減少食品安全問題提供參考。