馮宇佳，杜亞麗，趙慧婷，馬衛(wèi)華，李新宇，龍登隆，王春梅，姜玉鎖*

(1. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西太谷 030801；2. 山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，太原 030031；3. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太谷 030801)

嗅覺在昆蟲和環(huán)境之間起到關(guān)鍵的連接作用，因?yàn)槔ハx可以利用嗅覺來檢測刺激物，為其提供有關(guān)食物、捕食者和潛在配偶的信息(Bruceetal., 2005; Songetal., 2008)。研究在不同物種中編碼氣味受體蛋白的基因不僅可以了解這些生物之間的進(jìn)化關(guān)系，還可以認(rèn)識到有機(jī)體與生態(tài)環(huán)境之間的交互作用(Wuetal., 2017)。氣味受體作為直接參與嗅覺識別系統(tǒng)的蛋白之一，有著不可替代的作用。自然界中大量的氣味因子通過昆蟲嗅覺感覺表皮到達(dá)感器淋巴液中，與氣味結(jié)合蛋白或化學(xué)感受蛋白結(jié)合構(gòu)成復(fù)合體形式，復(fù)合體與嗅覺神經(jīng)元樹突膜上的氣味受體結(jié)合，使樹突膜改變了通透性，開啟了信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程(Rützler and Zwiebel, 2005)。對中華蜜蜂氣味受體基因的研究，可以為深入了解其嗅覺機(jī)制奠定一定基礎(chǔ)，以便更好地對其進(jìn)行保護(hù)和利用。

昆蟲的氣味受體可根據(jù)功能分為兩大類，一種是氣味共受體(odorant receptor coreceptor, Orco)，其在物種間高度保守，且無感知?dú)馕兜墓δ埽膳c傳統(tǒng)的氣味受體結(jié)合共同表達(dá)；另一種則是傳統(tǒng)的氣味受體(odorant receptors, Ors)，這種受體在昆蟲之間各不相同，可以辯別環(huán)境中豐富的氣味分子和信息素(Mombaerts, 1999; Kriegeretal., 2004)。典型的氣味受體有7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，具有與脊椎動(dòng)物截然相反的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)連接其N端，細(xì)胞膜的外側(cè)連接C端(Bentonetal., 2006; Lundinetal., 2007)，這與哺乳動(dòng)物作用機(jī)制完全相反，因此昆蟲的嗅覺識別機(jī)制非常特別，是通過離子門控方式來傳遞嗅覺信號(Satoetal., 2008; Wicheretal., 2008)，這使得昆蟲的嗅覺識別機(jī)制成為了研究熱點(diǎn)。近年來，基于基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)的飛速進(jìn)步，研究人員利用分子生物技術(shù)手段，相繼發(fā)現(xiàn)了不同昆蟲的ORs，如：在鱗翅目昆蟲堯仁扇舟蛾ClosterarestituraWalker(Guetal., 2019)和家蠶BombyxmoriLinnaeus(Wanneretal., 2007)中分別鑒定出78、48個(gè)ORs；在鞘翅目昆蟲稻水象甲LissorhoptrusoryzophilusKuschel(Zhangetal., 2019)和茶角胸葉甲Basileptamelanopus(Zhouetal., 2019)中分別鑒定出41、63個(gè)ORs；在直翅目昆蟲亞洲小車蝗Oedaleusdecorusasiaticus(Zhouetal., 2019)鑒定出60個(gè)ORs；在半翅目昆蟲中國梨喀木虱Cacopsyllachinensis(Xuetal., 2019)中鑒定出7個(gè)ORs；在雙翅目昆蟲岡比亞按蚊Anophelesgambiae(Foxetal., 2001)、埃及伊蚊Aedesaegypti(Bohbotetal., 2007)、黑腹果蠅Drosophilamelanogaster(Robertsonetal., 2003)中分別鑒別出79、131、62個(gè)ORs；在膜翅目昆蟲西方蜜蜂ApismelliferaLinnaeus中鑒別出170左右個(gè)ORs(Robertsonetal., 2006)，在中華蜜蜂Apisceranacerana足部(Duetal., 2019)鑒定出95個(gè)ORs。迄今為止，關(guān)于昆蟲氣味受體的各個(gè)方面都進(jìn)行了大量研究，如：結(jié)構(gòu)特征(Bentonetal., 2006; Wistrandetal., 2006)、異源表達(dá)(Radhikaetal., 2007; Songetal., 2009; Leeetal., 2016; Lietal., 2019)、組織特異性表達(dá)(Xuetal., 2013; Duetal., 2017; Liuetal., 2019; Tangetal., 2019)、功能(Marshalletal., 2010; Nicholsetal., 2016; Hughesetal., 2017; Guoetal., 2018; Katherineetal., 2019; Sunetal., 2019)和定位(Dwyeretal., 1998; Liuetal., 2013; Michael and Richard, 2013; Zhaoetal., 2015; Dietal., 2017)等。還有利用Orco與傳統(tǒng)ORs結(jié)合傳遞氣味分子的特點(diǎn)，研制出大量優(yōu)質(zhì)的Orco拮抗劑(Chen and Charles, 2012, 2013, 2014; Patricketal., 2012; Panagiotaetal., 2015)，通過變構(gòu)機(jī)制來抑制ORs的氣味激活，從而設(shè)計(jì)開發(fā)出以空氣為傳播途徑的優(yōu)質(zhì)驅(qū)蟲劑。

目前對于中華蜜蜂氣味受體的研究大多還停留在mRNA水平上(Yingetal., 2018; Duetal., 2019; Chenetal., 2019)，蛋白水平的研究也主要集中在共表達(dá)受體Orco(Zhaoetal., 2015; Zhangetal., 2016)，對于傳統(tǒng)氣味受體的表達(dá)及定位分析的研究還較少。本研究選擇中華蜜蜂氣味受體OR57為研究對象，在前期克隆獲得中華蜜蜂OR57全長的基礎(chǔ)上，利用quantitative real-time PCR、Western blot以及免疫組織化學(xué)技術(shù)對其在1日齡工蜂和采集蜂，1日齡雄蜂和性成熟雄蜂各部位中的表達(dá)差異及蛋白定位進(jìn)行了比較分析，以期為該基因的功能研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)蜜蜂

試驗(yàn)所用中華蜜蜂由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院實(shí)驗(yàn)蜂場提供。選取健康無病、群勢強(qiáng)壯、無自然分蜂傾向的中華蜜蜂蜂群，從蜂巢中抽取一張成熟的封蓋子脾(新蜂將要出房)置于34℃人工培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(RH 70%)，待其羽化出房后采集1日齡樣本；于上午10 ∶00點(diǎn)左右(蜜蜂采集高峰期)在巢門前抓取攜粉歸來的工蜂(采集蜂)；于下午14 ∶00～16 ∶00在巢門口抓取回巢的性成熟雄蜂。每個(gè)樣本各采集300頭，各自隨機(jī)分為3組，根據(jù)觸角、頭(去除觸角)、胸(去除足與翅膀)、腹、足等5個(gè)部位進(jìn)行分離。在各個(gè)樣本中，每100頭蜜蜂各部位的混合樣作為一個(gè)生物學(xué)重復(fù)。將所采集的部位立即投入到含有液氮的研缽中研磨至粉末狀，倒入裝有Trizol的 1.5 mL EP管中，放入超低溫冰箱(-80℃)中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

所用主要試劑為：Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser(perfect real time)、熒光定量試劑盒SYBR?Premix Ex TaqTMII(TliRNaseH Plus)等購自TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司；SDS、無水乙醇、Tween-20、Tris-base、TEMED等常規(guī)分析純購自北京索萊寶科技有限公司；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、微管蛋白β-tubulin、增強(qiáng)型RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑PMSF、0.22 μm NC膜、脫脂蛋白凍干粉、過硫酸銨等購自Bioss；SABC免疫組化染色試劑盒、DAB顯色試劑盒購自博士德；免疫組化筆、冰凍切片包埋劑購自康為世紀(jì)。

1.3 總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成

按照RNA提取步驟進(jìn)行各部位總RNA的提取，利用ND-1000核酸蛋白濃度測定儀測定其純度和濃度后，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈，反應(yīng)所需RNA總量為1 000 ng。將所獲cDNA模板放置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 熒光定量PCR

根據(jù)本課題組前期實(shí)驗(yàn)得到的中華蜜蜂OR57 cDNA的開放閱讀框設(shè)計(jì)特異性引物(F：5′-3AC CGCCATATGCAGGATAAA；R：5′-3′GGCCGAAA TTTGACCATCTA)，內(nèi)參使用Arp1(F：5′-3′AC TACGGCCGAACGTGAAAT；R：5′-3′GGAAAAG AGCCTCGGGACAA)，對該基因在中華蜜蜂1日齡工蜂和雄蜂，采集蜂和性成熟雄蜂5個(gè)部位中mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行RT-qPCR分析。

反應(yīng)體系為10 μL，其中SYBR Premix Ex TaqTM II(2x)加5 μL，ROX Refence Dye Ⅱ(50×)加0.2 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各加0.4 μL，ddH2O加3 μL，cDNA模板加1 μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30 s，循環(huán)條件為95℃ 5 s，62℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本都進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)。以各樣品所對應(yīng)的Arp1的Ct值為陽性對照，從而得到AcerOR57基因在不同樣本各部位的表達(dá)譜。

1.5 多克隆抗體的制備

以中華蜜蜂OR57蛋白全序列為模板，篩選并設(shè)計(jì)出兩條最佳肽段進(jìn)行合成并偶聯(lián)(抗原一：PINEPRNPNYEKDIAY；抗原二：ELMLKYGIIG RNLT)，使用HPLC和MS方法進(jìn)行檢測。檢測成功后，每條多肽免疫2只健康的新西蘭大白兔，至血清效價(jià)高于1 ∶10 000。檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)：抗原包被量2～5 μg/mL，ELISA檢測抗血清效價(jià)>1 ∶10 000。最后采用抗原親和純化的方法進(jìn)行抗體純化。檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)同上，ELISA檢測抗血清效價(jià)>1 ∶50 000。并委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.6 總蛋白的提取及Western blot檢測

按照組織裂解液試劑盒說明書，提取不同樣本各部位的總蛋白。用微量核酸蛋白濃度測定儀測定總蛋白濃度，加入10% SDS溶液調(diào)整至濃度基本一致(25～30 mg/mL)。

將不多于20 μL的各部位總蛋白加樣至10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中進(jìn)行檢測。首先恒壓80 V電泳30 min至溴酚藍(lán)層到達(dá)分離膠后，之后將電壓調(diào)至120 V，直到溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底端；電泳結(jié)束后，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，電壓調(diào)至100 V電泳100 min；將NC膜放于5%的脫脂奶粉中封閉1 h；封閉完成后用緩沖液TBS洗膜3次，TBST清洗1次，每次10 min；將清洗干凈的NC膜上加入多克隆一抗，4℃搖床孵育過夜；回收一抗，TBST洗膜3次，TBS清洗1次，每次10 min，加入山羊抗兔近紅外熒光二抗IRDye? 800CW，避光室溫孵育1 h；充分洗膜后，用Odyssey? CLx近紅外雙色熒光成像系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)果檢測。

1.7 冷凍切片與免疫組織化學(xué)定位檢測

采集不同樣本，取活蜜蜂的觸角，放在冰凍切片機(jī)中進(jìn)行切片，厚度約為5 μm。將切好的片在4%多聚甲醛溶液中進(jìn)行固定，30 min后，蒸餾水清洗2～3次；之后，放于30% H2O2與甲醇(1 ∶50)的混合液中，27～28℃下浸泡30 min，用以滅活切片組織中的內(nèi)源性過氧化物酶，蒸餾水清洗2～3次；將切片放于檸檬酸鹽緩沖溶液中，高溫煮沸，間隔10 min后，重復(fù)一次；冷卻后用免疫組化專用PBS清洗1～2次；在粘附有觸角的位置滴加2～3滴5% BSA封閉液，浸沒全部組織，27～28℃封閉1 h；甩去多余的封閉液，滴加提前配置好的一抗，4℃孵育12 h以上，同時(shí)設(shè)置陰性對照組(用PBS溶液代替一抗)；PBS洗3次，滴加生物素化山羊抗兔IgG，37℃孵育20 min；PBS洗3次，滴加試劑SABC，37℃孵育20 min；PBS洗4次。使用DAB顯色劑(藍(lán)紫色)進(jìn)行顯色，蒸餾水沖洗干凈后封片(中性樹脂)。光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果，用Image-Pro Plus 7.0軟件分析并拍照。

1.8 數(shù)據(jù)分析

熒光定量PCR結(jié)果應(yīng)用7500 Real-time PCR System軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析與處理。根據(jù)所得標(biāo)準(zhǔn)曲線和熒光曲線的Ct值，采用2-△△Ct法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。運(yùn)用SPSS 22.0 軟件中進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)，結(jié)合Duncan’s法完成顯著性差異分析。所得結(jié)果利用GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行作圖。

Western blot結(jié)果應(yīng)用Image Studio Ver 5.2軟件進(jìn)行分析處理。利用該軟件測定內(nèi)參和目的蛋白的灰度值，使用目的灰度/內(nèi)參灰度的計(jì)算方式進(jìn)行半定量分析。利用SPSS 22.0軟件進(jìn)行方差分析及差異顯著性檢驗(yàn)，并于GraphPad Prism 6.0軟件中作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 AcerOR57 mRNA在中華蜜蜂不同部位的表達(dá)譜分析

AcerOR57的轉(zhuǎn)錄本在1日齡工蜂和采集蜂，1日齡雄蜂和性成熟雄蜂各部位中均有表達(dá)。在1日齡工蜂和采集蜂中，觸角的表達(dá)量均高于其它部位，差異極顯著(P<0.01)。其它部位中，在1日齡工蜂的胸部表達(dá)量相對較高，頭部和足次之，但3個(gè)部位差異不顯著，腹部表達(dá)量最低，呈微量表達(dá)；在采集蜂其它部位中，頭部表達(dá)量相對較高，胸部和足次之，腹部同樣呈微量表達(dá)(圖1)。

在1日齡雄蜂和性成熟雄蜂中，頭部中的表達(dá)量均高于其它部位，差異極顯著(P<0.01)。在其它部位中，1日齡雄蜂胸部表達(dá)量相對較高，觸角次之，足中表達(dá)量最低；在性成熟雄蜂中，觸角的相對表達(dá)量較胸部略高，腹部次之，足中表達(dá)量最低。

2.2 多克隆抗體檢測

以中華蜜蜂采集蜂胸部為樣本，對AcerOR57多克隆抗體的質(zhì)量進(jìn)行檢測，其陽性結(jié)果(B)在目的蛋白分子量(46.5 kDa)處，條帶清晰，且無雜帶，陰性結(jié)果(A)的相應(yīng)位置無明顯條帶，表明該抗體確為目的蛋白抗體，且特異性良好(圖1)。

2.3 總蛋白提取效果檢測

性成熟雄蜂各部位蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果(R250考馬斯亮藍(lán)染色)如圖2。由圖可見，各部位蛋白條帶清晰，無拖尾，各個(gè)泳道之間沒有交叉，表明蛋白提取效果良好，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 中華蜜蜂AcerOR57在1日齡工蜂和采集蜂、1日齡雄蜂、性成熟雄蜂不同部位中的相對表達(dá)量Fig.1 Relative expression level of AcerOR57 mRNA in different parts of 1-day-old workers，forager,1-day-old and sexually mature drones of Apis cerana cerana注：An, 觸角; H, 頭(去除觸角); T, 胸Thorax; Ab, 腹; L, 足。柱狀圖上不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。Notes: An, Antenna; H, Head without antenna; T, Thorax; Ab, Abdomen; L, Legs.Different capital letters above the bars indicate significant different(P<0.01).

圖2 中華蜜蜂AcerOR57多克隆抗體檢測陰性(A)和陽性(B)結(jié)果Fig.2 Negative (A) and positive (B) serum results of AcerOR57 polyclonal antibody test in Apis cerana cerana注: 1、2、3, 采集蜂胸部樣本的3個(gè)重復(fù); M, 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)。Notes: 1、2、3, Three repetitions of foragers about thorax; M, Molecular weight maekers of standard protein.

圖3 性成熟雄蜂各部位蛋白提取結(jié)果的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果Fig.3 SDS-polyacrylamide gel electrophoresis about protein samplesin different parts of sexually mature drones注: 1, 觸角; 2, 頭(去除觸角); 3, 胸; 4, 腹; 5, 足; M, 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)。Notes: 1, Antenna; 2, Head (without antenna); 3, Thorax; 4, Abdomen; 5, Legs; M, Molecular weight maekers of standard protein.

2.4 AcerOR57受體蛋白在中華蜜蜂各部位的表達(dá)分析

AcerOR57在1日齡工蜂和采集蜂，1日齡雄蜂和性成熟雄蜂各部位中蛋白表達(dá)結(jié)果如圖4、圖5所示，該蛋白在1日齡工蜂和采集蜂，1日齡雄蜂和性成熟雄蜂的觸角、頭、胸、腹和足各個(gè)部位中均有表達(dá)。

圖4 中華蜜蜂AcerOR57在中華蜜蜂不同部位中的表達(dá)量Fig.4 Expression of AcerOR57 protein in different parts of of Apis cerana cerana注: 1, 觸角; 2, 頭(去除觸角); 3, 胸; 4, 腹; 5, 足。Notes:1, Antenna; 2, Head ( without antenna); 3, Thorax; 4, Abdomen; 5, Legs.

圖5 中華蜜蜂AcerOR57在1日齡工蜂、采集蜂、1日齡雄蜂和性成熟雄蜂不同部位中蛋白的相對表達(dá)量Fig.5 Relative expression level of AcerOR57 protein in different parts of 1-day-old worker，forager, 1-day-old and sexually mature drone of Apis cerana cerana注: An, 觸角; H, 頭(去除觸角); T, 胸; Ab, 腹; L, 足。柱狀圖上不同大寫字母表示差極異顯著(P<0.01)。Notes: An, Antenna; H, Head without antenna; T, Thorax; Ab, Abdomen; L, Legs. Different capital letters above the bars indicate significant different(P<0.01).

根據(jù)Western blot結(jié)果，由于腹部內(nèi)參不表達(dá)，導(dǎo)致圖5中腹部結(jié)果無法顯示，因此，結(jié)果分析只在除腹部以外的其它部位中進(jìn)行。1日齡工蜂和采集蜂中，觸角的表達(dá)量最高，與其它部位差異極顯著(P<0.01)；在1日齡雄蜂和性成熟雄蜂中，觸角和頭部的表達(dá)都極低；在雄蜂的其它部位中，1日齡足部及性成熟雄蜂胸部的表達(dá)量均高于其它部位，差異極顯著(P<0.01)。

2.5 AcerOR57受體蛋白在中華蜜蜂觸角中的定位分析

本試驗(yàn)使用前期制備的AcerOR57抗體，對各樣本觸角切片進(jìn)行免疫組化反應(yīng)，采用DAB(藍(lán)紫色)染色，陽性結(jié)果出現(xiàn)藍(lán)紫色點(diǎn)狀或圓盤狀，背景為淡紫色。陰性結(jié)果的背景則是無色或淡紫色，沒有明顯的結(jié)果，說明試驗(yàn)結(jié)果特異性良好。

免疫組化結(jié)果顯示，AcerOR57在中華蜜蜂觸角的鞭節(jié)中均有表達(dá)。AcerOR57在1日齡工蜂和雄蜂及性成熟雄蜂觸角中的表達(dá)結(jié)果為：點(diǎn)狀(圖6中藍(lán)色箭頭所指)、圓盤狀(圖6中黃色箭頭所指)以及長條狀(圖6中黑色箭頭所指)，采集蜂中只呈現(xiàn)點(diǎn)狀和圓盤狀表達(dá)結(jié)果，推測AcerOR57在觸角的板形感器、毛形感器和錐形感器中有表達(dá)。

在1日齡工蜂和性成熟雄蜂中，點(diǎn)狀表達(dá)結(jié)果所占的比例比圓盤狀多；在1日齡雄蜂和采集蜂中，板形感器的表達(dá)相對較多，毛形感器較少。在所有樣本中，長條狀結(jié)果最為不明顯，只有零星幾處?？偟膩碚f，在1日齡工蜂和性成熟雄蜂中，AcerOR57主要在毛形感器中表達(dá)，在1日齡雄蜂和采集蜂中，主要在板形感器中表達(dá)。雄蜂中感器的分布明顯少于工蜂。

3 討論與結(jié)論

蜜蜂是一種高度社會(huì)性生活的昆蟲，通過個(gè)體間合作，形成了有著完備通訊和社會(huì)分工合作的系統(tǒng)，以適應(yīng)千變?nèi)f化的自然環(huán)境。有大量數(shù)據(jù)表明，昆蟲氣味受體基因一般位于觸角中，但在下顎須以及喙中也存在大量的嗅覺感受器(Olafsonetal., 2013; Kongetal., 2014)。掃描電鏡結(jié)果顯示，中華蜜蜂工蜂觸角鞭節(jié)上存在7種感受器，而在雄蜂中發(fā)現(xiàn)6種(Zhaoetal., 2019)。其中，板形感器、錐形感器、毛形感器和栓錐形感器與蜜蜂的嗅覺感受相關(guān)(Fengetal., 1992; JINetal., 2004; Faucheuxetal., 2006; Ahmedetal., 2013)。本研究對中華蜜蜂1日齡工蜂和采集蜂，1日齡雄蜂和性成熟雄蜂的觸角、頭、胸、腹、足5個(gè)部位中OR57轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)譜所做的分析表明，該基因主要在1日齡工蜂和采集蜂觸角中高表達(dá)，這與潘建芳(Pan, 2016)的研究結(jié)果相一致。該基因還在1日齡雄蜂和性成熟雄蜂頭部中高表達(dá)，推測可能是喙和下顎須包含于其中的原因，Wanner等發(fā)現(xiàn)在雄蜂觸角中高度表達(dá)的氣味受體為性信息素受體的可能性很高(Wanneretal., 2007)，故推測AcerOR57可能在雄蜂攝取食物的過程中起作用，且其并非性信息素受體。

目前很少有研究報(bào)道關(guān)于昆蟲傳統(tǒng)氣味受體蛋白表達(dá)特性。本研究利用Western blot技術(shù)對AcerOR57蛋白在不同樣本各部位的表達(dá)特性進(jìn)行研究。結(jié)果顯示，AcerOR57在1日齡工蜂和采集蜂觸角中表達(dá)最多，這與前期RT-qPCR的試驗(yàn)結(jié)果相吻合，這也從蛋白水平驗(yàn)證了OR57在工蜂中的表達(dá)特性。而在1日齡雄蜂和性成熟雄蜂中，AcerOR57的蛋白表達(dá)量與前期熒光定量的結(jié)果大不相同，這可能是由于AcerOR57在表達(dá)過程中，發(fā)生了轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。蜜蜂是一種高度社會(huì)性生活的昆蟲，在蜂群這樣的“超生物體”中，盡管單個(gè)蜜蜂難以獨(dú)立生存，但通過個(gè)體合作，蜂群形成了具有高度發(fā)達(dá)的通訊和社會(huì)分工合作系統(tǒng)，能適應(yīng)多變的環(huán)境條件。在一個(gè)蜂群里，工蜂的數(shù)量最多，擔(dān)任了除產(chǎn)卵以外的所有工作，1日齡工蜂主要在巢內(nèi)進(jìn)行保溫孵卵、清理巢房的工作；而采集蜂作為壯年個(gè)體，主要在巢外進(jìn)行采集花蜜、水、花粉、蜂膠及巢門防衛(wèi)的工作(Beshers SNetal., 2001)，因此，有更多機(jī)會(huì)接觸不同種類的氣味分子。雄蜂的唯一任務(wù)就是保證與處女王的交配，在交配季節(jié)，性成熟的雄蜂會(huì)自動(dòng)聚集在某空域中，招引處女王(Rangeletal., 2013)。采集蜂需要外出采集外界的蜜粉源，AcerOR57在采集蜂觸角中高表達(dá)，而在雄蜂中表達(dá)低或不表達(dá)，從另一個(gè)角度說明該氣味受體并非性信息素受體。

本研究前期曾使用了α-actin、β-actin、α-tublin、β-tublin、GAPDH 5種內(nèi)參蛋白抗體來檢測中華蜜蜂腹部內(nèi)參表達(dá)情況，但均未出現(xiàn)蛋白條帶。根據(jù)β-actin序列設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，其在蜜蜂不同部位(觸角、頭、胸部、腹部、足)均可檢測出表達(dá)結(jié)果。故筆者推測，可能是由于腹部除消化系統(tǒng)外，只有少量肌肉來輔助運(yùn)動(dòng)，不利于蛋白內(nèi)參的檢測，所以Western blot內(nèi)參結(jié)果未出，但不影響目的蛋白檢測，具體原因還需進(jìn)一步的探究。

圖6 中華蜜蜂AcerOR57在1日齡工蜂、采集蜂、1日齡雄蜂和性成熟雄蜂觸角上的定位Fig.6 Localization of AcerOR57 in antennae of 1-day-old workers and forager, 1-day-old and sexually mature drones of Apis cerana cerana注: A, AcerOR57在1日齡工蜂觸角中的陰性表達(dá)結(jié)果; A1, AcerOR57在1日齡工蜂觸角中的陽性表達(dá)結(jié)果; B, AcerOR57在采集蜂觸角中的陰性表達(dá)結(jié)果; B1, AcerOR57在采集蜂觸角中的陽性表達(dá)結(jié)果; C, AcerOR57在1日齡雄蜂觸角中的陰性表達(dá)結(jié)果; C1, AcerOR57在1日齡雄蜂觸角中的陽性表達(dá)結(jié)果; D, AcerOR57在性成熟雄蜂觸角中的陰性表達(dá)結(jié)果; D1, AcerOR57在性成熟雄蜂觸角中的陽性表達(dá)結(jié)果。Notes: A, Negative expression result of AcerOR57 in the antenna of 1-day-old; A1, Positive expression result of AcerOR57 in the antenna of 1day workers ; B, Negative expression result of AcerOR57 in the antenna of forager; B1, Positive expression result of AcerOr57 in the antenna of forager; C, Negative expression result of AcerOR57 in the antenna of 1-day-old; C1, Positive expression result of AcerOR57 in the antenna of 1-day-old drones ; D, Negative expression result of AcerOR57 in the antenna of sexually mature drones; D1, Positive expression result of AcerOr57 in the antenna of sexually mature drones.

目前，關(guān)于蜜蜂氣味受體基因的表達(dá)及定位研究，大多采用的是原位雜交的方法，包括You等將LmigOR3定位于毛狀感器的神經(jīng)元中(Youetal., 2016)；Tim等證明了岡比亞按蚊中不同的氣味受體會(huì)在相應(yīng)的嗅覺神經(jīng)元中表達(dá)(Timetal., 2015)。本課題組前期同樣利用原位雜交技術(shù)對氣味受體蛋白Orco在中華蜜蜂觸角上的表達(dá)進(jìn)行了定位分析(Zhaoetal., 2013; Zhaoetal., 2015)。本研究采用免疫組化技術(shù)對AcerOR57受體蛋白表達(dá)特性進(jìn)行探究，發(fā)現(xiàn)其在中華蜜蜂觸角鞭節(jié)中有點(diǎn)狀、圓盤狀及長條狀表達(dá)，由于長條狀結(jié)果均出現(xiàn)在工蜂和雄蜂中，故猜測其可能為錐形感器。與AcerOrco(Zhangetal., 2016)相比，AcerOR57的分布分散且少，這可能是由于AcerOrco作為共受體，在嗅覺感器中的分布比傳統(tǒng)氣味受體多的原因。同時(shí)，本研究結(jié)果還顯示，AcerOR57在雄蜂中感器的分布明顯少于工蜂，故推測該蛋白在識別外界普通氣味分子中發(fā)揮重要作用。