劉明月，陳佳玉，常 晨，劉紅玲

0引言

視網(wǎng)膜靜脈阻塞(retinal vein occlusion，RVO)是一種視網(wǎng)膜血管疾病，通常分為中央型視網(wǎng)膜靜脈阻塞(central retinal vein occlusion，CRVO)與分支型視網(wǎng)膜靜脈阻塞(branch retinal vein occlusion，BRVO)兩種亞型，可顯著損害老年患者的視力[1]。目前，其確切病因和發(fā)病機制尚未明確，但研究發(fā)現(xiàn)動脈硬化與其發(fā)生具有一定相關(guān)性。解剖學(xué)上，視網(wǎng)膜血管壁及外周包被鞘膜發(fā)生硬化時，可引起與其交叉的視網(wǎng)膜靜脈淤滯或靜脈內(nèi)血流中斷，繼發(fā)視網(wǎng)膜靜脈阻塞。流行病學(xué)上，Kolar[2]對包括北京眼科研究中心提供資料在內(nèi)的4000多例RVO患者臨床資料進行分析，總結(jié)RVO發(fā)生的全身和局部危險因素，指出動脈硬化相關(guān)疾病是RVO發(fā)生的全身危險因素之一。動脈硬化是一種慢性炎癥性疾病，其發(fā)生發(fā)展受多種炎癥因子調(diào)控。炎癥因子是一組多樣性的低分子量蛋白質(zhì)，主要分為白介素、趨化因子、集落刺激因子等眾多家族，Dipak等2015年對炎癥因子在動脈硬化中的作用進行總結(jié)，指出炎癥因子可通過活化內(nèi)皮細胞，促進黏附分子表達，促進免疫細胞募集等功能，參與動脈硬化脂質(zhì)條紋形成，斑塊形成，穩(wěn)定性破壞，斑塊破裂血栓形成等過程[3]。近年來針對視網(wǎng)膜靜脈阻塞患者房水及玻璃體組織檢測的結(jié)果也提示炎癥及動脈硬化相關(guān)因子在RVO患者眼內(nèi)存在異常表達現(xiàn)象[4-6]。而RVO患者眼內(nèi)炎癥因子異常表達究竟是疾病的繼發(fā)反應(yīng)，還是全身異常狀態(tài)的局部表現(xiàn)，尚缺乏相關(guān)研究，故本試驗選定與動脈粥樣硬化及炎癥反應(yīng)具有緊密聯(lián)系的白介素6(interleukin-6，IL-6)、脂聯(lián)素(adiponectin，ADPN)、Apelin、超敏C反應(yīng)蛋白(hypersensitive C reactive protein，hs-CRP)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，通過ELISA法檢測其在RVO患者血清中表達情況，從分子角度探查炎癥及動脈硬化相關(guān)因子與視網(wǎng)膜靜脈阻塞的關(guān)聯(lián)。

1對象和方法

1.1對象本試驗為橫斷面研究，選取2017-08/12于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院眼科醫(yī)院就診且行眼底造影明確診斷為視網(wǎng)膜靜脈阻塞患者72例為研究對象，根據(jù)病種不同，分為BRVO組和CRVO組，其中BRVO組35例，CRVO組37例，排除各種急性炎癥性疾病、惡性腫瘤、全身免疫性疾病、肝腎功能異常、近期服用抗炎藥、近期重大手術(shù)史、合并其它眼底疾病(如視網(wǎng)膜靜脈周圍炎、糖尿病視網(wǎng)膜病變等)等可能對檢測結(jié)果造成影響的情況，另外選擇32例性別、年齡與試驗組相近且不合并其它疾病的年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者作為對照組。術(shù)前三組患者基線情況見表1，組間情況無統(tǒng)計學(xué)差異，具有可比性。本研究遵循《赫爾辛基宣言》，并通過哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會審批(醫(yī)研倫審2016第47號)，所有患者在參與試驗前均需簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1術(shù)前眼科查體及輔助檢查由同一臨床工作組醫(yī)師進行病史采集、基本信息收集(試驗組與對照組性別、年齡、身高、體質(zhì)量均已行統(tǒng)計分析且無明顯差異)，及視力、裂隙燈、直接眼底鏡檢查，所有患者均需行OCT，F(xiàn)FA檢查。

1.2.2患者術(shù)前血清收集患者知情同意后于靜息狀態(tài)下采其空腹靜脈血收集于干燥無抗凝劑采血管內(nèi)，室溫放置2h后1000g離心20min，取上清液分裝、凍存，試驗當(dāng)天解凍。采血及分裝操作均由同一組臨床醫(yī)護人員完成。

圖1三組Apelin值比較。

表1 術(shù)前患者基線情況

基線資料BRVOCRVO對照組例數(shù)373532性別(男/女,例)22/1523/1213/19年齡( x±s,歲)55.97±7.6755.43±14.259.94±9.37身高( x±s,cm)160.75±7.34161.7±7.8161.2±7.99體質(zhì)量( x±s,kg)60.76±8.3761.2±7.1160.39±9.21BMI( x±s,kg/m2)21.83±2.3221.71±1.6121.5±2.28

1.2.3血清因子濃度檢測患者血清因子濃度采用ELISA法檢測，分別檢測血清IL-6、ADPN、Apelin、hs-CRP、VEGF水平，檢測操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書執(zhí)行，每樣血清因子至少重復(fù)檢測兩次。Origin.8軟件進行結(jié)果分析。

2結(jié)果

2.1 三組患者血清Apelin、IL-6、ADPN、hs-CRP、VEGF值情況BRVO組Apelin為6.69(4.25,10.52)ng/mL，CRVO組為7.12(3.78,8.58)ng/mL，對照組為1.19(0.74,1.49)ng/mL，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=51.740，P<0.01)；BRVO組、CRVO組均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；BRVO組與CRVO組Apelin值比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2，圖1。三組IL-6、ADPN、hs-CRP、VEGF比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2，圖2～5。

2.2 Apelin、IL-6、ADPN、hs-CRP、VEGF與患者視力及黃斑水腫程度的相關(guān)性結(jié)果顯示，血清Apelin、IL-6、ADPN、hs-CRP、VEGF水平與視力及黃斑中央凹厚度均無相關(guān)性，見表3。

3討論

視網(wǎng)膜靜脈阻塞是一種常見的視網(wǎng)膜血管性疾病，由其繼發(fā)的黃斑水腫、視網(wǎng)膜缺血、視網(wǎng)膜出血常導(dǎo)致患者視力的嚴(yán)重下降，影響患者生活質(zhì)量。由于RVO是一種多因素致病的疾病，其發(fā)生機制至今仍未明確。流行病學(xué)調(diào)查顯示高血壓、高脂血癥、糖尿病、血栓形成和血液高凝狀態(tài)、全身性炎癥性疾病等均與RVO發(fā)生具有一定相關(guān)性。在大多數(shù)情況下，動脈疾病是RVO發(fā)生病因之一。視網(wǎng)膜中央動靜脈由同一血管鞘膜包被，當(dāng)視網(wǎng)膜中央動脈及外周鞘膜硬化時，視網(wǎng)膜中央靜脈極易被壓迫而導(dǎo)致CRVO發(fā)生；而當(dāng)動靜脈交叉處的視網(wǎng)膜分支動脈發(fā)生硬化時，會壓迫與之交叉的視網(wǎng)膜分支靜脈，導(dǎo)致BRVO的發(fā)生。也有學(xué)者推測動脈硬化可能導(dǎo)致相應(yīng)細胞因子升高，升高的細胞因子擴散到臨近靜脈，刺激靜脈血管受損與血栓形成，增加RVO的發(fā)生幾率[7-9]。

表2 三組患者血清Apelin、IL-6、ADPN、hs-CRP、VEGF值M(P25,P75)

圖2三組血清ADPN比較。

圖3三組血清IL-6比較。

圖4三組血清hs-CRP比較。

圖5三組血清VEGF比較。

表3 RVO患者血清Apelin、IL-6、ADPN、hs-CRP、VEGF與CMT、視力相關(guān)性分析

指標(biāo)ApelinADPNIL-6hs-CRPVEGFCMTrsP0.0580.6700.0560.6590.1750.1510.0590.6470.0570.644視力rsP0.0900.4520.1110.3510.0520.9650.1510.2040.0910.939

本試驗檢測了RVO患者血清中動脈硬化相關(guān)因子Apelin、IL-6、ADPN、hs-CRP、VEGF的表達情況，在細胞因子水平探查可能導(dǎo)致RVO發(fā)生的危險因素。結(jié)果顯示Apelin在BRVO、CRVO患者血清的表達均顯著高于對照組，推測Apelin可能為RVO發(fā)生的相關(guān)危險因素之一。Apelin是一種由脂肪細胞分泌并參與機體血壓、血糖、血脂調(diào)節(jié)以及血管生成等多種病理生理反應(yīng)的生物活性肽，早前試驗證實，Apelin與其配體結(jié)合后，通過誘導(dǎo)磷脂酰肌醇3-激酶磷酸化，激活下游信號分子，促進細胞周期蛋白D1合成，最終導(dǎo)致平滑肌細胞的增殖。同時Apelin與人體總膽固醇含量呈正相關(guān)，推測Apelin與脂質(zhì)代謝密切相關(guān)。張顯靜等的研究也證實Apelin可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞中細胞間粘附因子(ICAM-1)和血管細胞粘附分子(VCAM-1)表達[10-12]，誘導(dǎo)單核細胞粘附而發(fā)揮促動脈硬化的作用。也有研究指出，Apelin可抑制血管緊張素作用，促進NO分泌，減輕氧化應(yīng)激對血管壁的刺激作用而發(fā)揮抑制動脈硬化的作用。陳珺[13]發(fā)現(xiàn)，糖尿病伴動脈硬化患者血清Apelin水平較對照組顯著降低，且隨動脈硬化分級增加而降低。張佳[14]也通過對小鼠進行Apelin處理證實，Apelin可能通過抑制TGF表達抑制平滑肌細胞增殖減輕糖尿病動物模型動脈纖維化現(xiàn)象。目前關(guān)于Apelin在眼科疾病的特異性表達，尚缺乏相關(guān)報道，在本試驗中Apelin在BRVO、CRVO患者血清的表達均顯著高于對照組，我們推測Apelin可能通過誘導(dǎo)視網(wǎng)膜血管平滑肌細胞增殖、促進細胞間黏附分子表達而對視網(wǎng)膜局部血管造成損傷，促進局部血栓形成，導(dǎo)致視網(wǎng)膜靜脈阻塞發(fā)生。但由于Apelin參與機體血壓、血糖、血脂調(diào)節(jié)以及血管生成等多種病理生理反應(yīng)，作用途徑繁雜，其參與RVO發(fā)生的具體機制仍有待進一步研究證實。

ADPN是一種主要由脂肪細胞分泌的，與胰島素敏感性緊密相關(guān)的特異性蛋白質(zhì)，具有胰島素增敏，抗心肌細胞肥大，抑制成纖維細胞增殖以及預(yù)防心肌纖維化的作用[15]。ADPN具有抗動脈粥樣硬化的作用，ADPN濃度與動脈硬化檢查指標(biāo)之一的頸動脈內(nèi)膜中層厚度呈負相關(guān)，且低脂聯(lián)素水平可能會加重冠心病患者經(jīng)皮冠狀動脈介入治療后心臟損害和功能障礙的幾率，動物實驗證實ADPN基因敲除鼠存在動脈硬化加速現(xiàn)象，體外試驗證實ADPN可降低腫瘤壞死因子對血管內(nèi)皮細胞的刺激，減少細胞間黏附分子的表達[16]。因ADPN同Apelin在心血管疾病的表達及作用近年來才逐漸成為相關(guān)專業(yè)的研究熱點，其與眼部疾病的相關(guān)性尚未引起關(guān)注，暫未見相關(guān)報道，而其在心血管疾病中的重要作用在近年多有證實，這也是本試驗選取該兩項因子作為檢測指標(biāo)的主要原因之一。Apelin的特異性表達上文已描述。在本試驗中，ADPN在RVO患者血清中的表達情況與對照組相比未見顯著差異。對此我們推測，ADPN作為抗動脈硬化的細胞因子，其特異性表達更大可能發(fā)生在已經(jīng)發(fā)生動脈硬化或動脈硬化程度較重的患者，而對于RVO患者，更多可能未發(fā)生動脈硬化或病損程度較輕，在該前提下，ADPN有極大可能在RVO患者血清中不存在特異性表達。

同時與動脈硬化和炎癥緊密相關(guān)的細胞因子IL-6、CRP也是本試驗著重檢測的指標(biāo)之一。IL-6、CRP是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的重要標(biāo)記物。IL-6由單核細胞、內(nèi)皮細胞、血管平滑肌細胞生成，在心血管危險因素和前炎癥因子的作用下，內(nèi)皮細胞等生成IL-6，IL-6刺激肝臟等器官產(chǎn)生C反應(yīng)蛋白(CRP)等急性反應(yīng)蛋白，在炎癥因子作用下引起血管炎癥反應(yīng)、單核細胞沉積等，逐漸發(fā)展為動脈粥樣硬化；而主要由肝臟產(chǎn)生的CRP，也被大量研究證實是心血管疾病的危險因素，實驗發(fā)現(xiàn)CRP水平與內(nèi)皮功能狀態(tài)呈負相關(guān)，CRP可導(dǎo)致一氧化氮合酶產(chǎn)生減少，抑制一氧化氮釋放，損傷內(nèi)皮功能，同時刺激巨噬細胞、內(nèi)皮細胞、血管平滑肌細胞分泌MCP-1、IL-6、TNF等因子，進一步加劇動脈炎癥反應(yīng)，刺激血栓形成與動脈硬化發(fā)生[3]。此前亦有報道IL-6在RVO患者玻璃體及房水中的高表達現(xiàn)象[17-18]，據(jù)此，我們推測，IL-6和CRP在RVO患者血清中可能存在高表達現(xiàn)象，其通過引起視網(wǎng)膜血管炎癥反應(yīng)，損傷內(nèi)皮，刺激血栓形成而導(dǎo)致血管阻塞，但檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，其表達并未發(fā)現(xiàn)顯著差異。炎癥介質(zhì)如IL-6在動脈粥樣斑塊處的表達可上調(diào)VEGF的表達。正常血管組織中通常不存在VEGF受體表達，試驗證實氧化型低密度脂蛋白可刺激VEGF表達，而動脈管壁的狹窄等病理改變造成的組織缺氧，也會導(dǎo)致VEGF受體的表達增加，VEGF可導(dǎo)致病理性新生血管生成，破壞斑塊穩(wěn)定，刺激斑塊破裂，促進動脈硬化疾病進展。多項房水檢測的結(jié)果亦顯示RVO患眼中存在VEGF表達增高的現(xiàn)象。體外試驗亦證明外源性VEGF可促進血管內(nèi)皮細胞增殖，加快新生血管生成，并增加管壁通透性。視網(wǎng)膜血管管壁通透性增加可導(dǎo)致黃斑水腫加重，患者視力下降，針對VEGF發(fā)揮作用的抗VEGF類藥物被證實可改善RVO患者視力[19-20]。而在本試驗中，RVO患者血清VEGF水平相較對照組有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。對于IL-6、CRP、VEGF三項因子在試驗組與對照組中未發(fā)現(xiàn)顯著差異的現(xiàn)象，我們分析可能如下：(1)外周血中炎癥及動脈硬化相關(guān)因子濃度在RVO急性期無高表達現(xiàn)象?，F(xiàn)有文獻對RVO與外周血細胞因子報道較少，董寧等[21]以同型半胱氨酸作為檢測指標(biāo)的試驗顯示，在CRVO急性期，患者血清同型半胱氨酸、維生素B12含量與對照組比較無明顯差異。但對比歷史就診資料，發(fā)現(xiàn)患者在疾病發(fā)生前的空腹血清同型半胱氨酸值高于正常對照組，且后續(xù)研究中，隨病程進展，RVO患者血清同型半胱氨酸在急性期至恢復(fù)期又逐漸升高，得出同型半胱氨酸為視網(wǎng)膜靜脈阻塞獨立危險因素的結(jié)論。對比該試驗，本試驗為橫斷面研究，入選患者大部分處于急性期，可能存在相關(guān)因子表達無增加甚至下降現(xiàn)象，其后續(xù)變化過程未知，對此，需在后期試驗中檢測RVO進展過程中包括Apelin在內(nèi)的五項因子表達情況以行對照論證。(2)眼內(nèi)局部環(huán)境病理反應(yīng)受外周血液中炎癥及動脈硬化相關(guān)因子水平影響較低。國內(nèi)外多項研究證實，在RVO眼內(nèi)房水或玻璃體組織中存在IL-6、VEGF等因子表達上升現(xiàn)象，且因子濃度與RVO眼黃斑水腫程度及視網(wǎng)膜缺血程度相一致[18, 22-23]。但由于眼部結(jié)構(gòu)的特殊性，血視網(wǎng)膜屏障的存在，加大了全身血液中相關(guān)因子擴散至眼內(nèi)組織的困難程度，此前亦有報道稱血漿與房水因子水平不具相關(guān)性，故此，RVO本身不存在外周血相關(guān)因子表達上調(diào)，也可能是造成本試驗中ADPN等四項因子與對照組無明顯表達差異的原因之一。在試驗條件允許的情況下，可加測房水因子水平與血清對比以證實猜測。(3)試驗組患者的藥物治療史可能對血清因子水平造成影響。本試驗中，RVO患者伴高血壓者23例，糖尿病患者13例，患者多長期行高血壓、糖尿病藥物治療史，相應(yīng)藥物藥物治療可能造成血清相關(guān)因子的下降也可能對試驗結(jié)果造成一定影響。后兩種可能，同樣可用于解釋本試驗中RVO患者血清ADPN無特異性表達現(xiàn)象。

綜合上述，五種因子在RVO患者血清中的表達情況，推測Apelin可能為RVO發(fā)生的危險因素之一，ADPN、IL-6、hs-CRP、VEGF在RVO急性期未見特異性表達，但仍需進一步試驗明確其在RVO病程中的動態(tài)變化情況，在可能情況下輔以房水因子檢測以明確外周血因子濃度與局部眼病間是否存在關(guān)聯(lián)。