李鵑，蔡潔行，張崢，朱煥章

（1.復(fù)旦大學(xué)，上海 200433；2.上海藥明生物技術(shù)有限公司，上海 200131）

隨著生物制藥行業(yè)的蓬勃發(fā)展，CHO細(xì)胞蛋白生產(chǎn)的需求日益增加[1]。細(xì)胞群批次補(bǔ)料可以在較短時(shí)間內(nèi)提供克級(jí)以上蛋白用于研發(fā)等用途，因此其應(yīng)用越來越廣泛[2]。批次補(bǔ)料過程中，各種代謝廢物也在培養(yǎng)體系中不斷堆積，造成細(xì)胞周圍環(huán)境逐漸惡化[3-5]，細(xì)胞活率降低，從而影響蛋白最終產(chǎn)量。

本研究針對(duì)丙酮酸脫氫酶激酶3（PDHK3）設(shè)計(jì)3組特定的shRNA（PDHK3-1、PDHK3-2、PDHK3-3），并將其分別克隆至WuXi Biologics載體中。為加強(qiáng)shRNA的抑制效果，將設(shè)計(jì)的3組shRNA以1∶1∶1進(jìn)行混合，在CHO細(xì)胞群構(gòu)建時(shí)將含有這些混合質(zhì)粒與待表達(dá)蛋白的質(zhì)粒一同轉(zhuǎn)染進(jìn)入宿主細(xì)胞中。在批次補(bǔ)料實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，通過轉(zhuǎn)染8組不同的蛋白分子，批次補(bǔ)料過程中每一組的乳酸含量均得到明顯降低，同時(shí)蛋白表達(dá)量得到顯著提高。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑、試劑盒與儀器

shRNA質(zhì)粒提取使用試劑盒（MACHEREYNAGEL）；PDHK3基因mRNA水平檢測(cè)使用RTPCR試劑盒（Invitrogen）及PCR試劑盒（TaKaRa）；轉(zhuǎn)染過程使用電轉(zhuǎn)試劑（Lonza）。

Vicell細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（Beckman，XR）、細(xì)胞培養(yǎng)生化分析儀（NoVa，F(xiàn)LEX）、高效液相色譜（HPLC）（Agilent，1260 Infinity Ⅱ）

1.1.2 質(zhì)粒、菌株與宿主細(xì)胞

質(zhì)粒、菌株、細(xì)胞系等宿主細(xì)胞CHOK1、WuXi Bio表達(dá)載體和感受態(tài)TOP10為WuXi Biologics平臺(tái)所有，PDHK3-shRNA及shRNA陰性對(duì)照的目的基因合成由蘇州金唯智生物科技有限公司完成，含有PDHK3-shRNA或者shRNA陰性對(duì)照的目的基因由蘇州金唯智生物科技有限公司克隆至WuXiBio表達(dá)載體，完成重組菌株的制備。

1.1.3 引物與探針

1.1.3.1 PDHK3基因的mRNA水平檢測(cè)

正向引物：TGGCGAACACAATGAGAGAAGT；反向引物：TGCATGTACCAACTCTGAACTAATCC；探針：AATCTTTTGCCGGATAAC。

1.1.3.2 neomycin基因拷貝數(shù)檢測(cè)

正向引物：TGCCGAATATCATGGTGGAA；反向引物：GCCAAGCTCTTCAGCAATATCA；探針：TGGCCGCTTTTCT。

1.2 方法

1.2.1 shRNA質(zhì)粒的構(gòu)建

選取PDHK3的3個(gè)目的區(qū)域：5’-GGACTTCGGAAGAGATAATGC-3’（ORF 327～347）；5’-GCTACTCTGTGAACAGTATTA-3’（ORF 843～863）；5’-GCCCTTTCAAGTGAATCATTT-3’（ORF1306～1326）。

含有PDHK3基因的shRNA質(zhì)粒設(shè)計(jì)為含有反向互補(bǔ)的目的基因序列，中間由一莖環(huán)（TTGATATCC）序列分割，組成短發(fā)夾結(jié)構(gòu)。

同時(shí)設(shè)計(jì)含有陰性對(duì)照shRNA的質(zhì)粒：GTCGC TTACCGATTCAGAATGGTTGATATCCGCCATTCTGA ATCGGTAAGCGAC。

合成以上基因序列，分別添加 5’（BamHI）、3’UTR（[ACATTGATTATTG]）和 3’（SpeI），將基因通過 5’BamHI和 3’SpeI克隆至載體 WuXi Bio 表達(dá)載體（Ampicillin），制備重組質(zhì)粒DNA及重組菌株。

1.2.2 宿主CHOK1細(xì)胞培養(yǎng)

宿主CHOK1細(xì)胞使用搖瓶在CD CHO培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)，每隔3～4 d進(jìn)行傳代，搖床培養(yǎng)條件為溫度36.5 ℃，二氧化碳濃度6.0%。

1.2.3 轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞并進(jìn)行加壓篩選構(gòu)建細(xì)胞系

使用電轉(zhuǎn)試劑（Lonza）進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染條件設(shè)置見表1。

表1 轉(zhuǎn)染條件設(shè)置

單獨(dú)轉(zhuǎn)染含有表達(dá)目的蛋白質(zhì)粒，共轉(zhuǎn)含有針對(duì)PDHK3-shRNA（1+2+3）的混合質(zhì)粒和含有表達(dá)目的蛋白質(zhì)粒，單獨(dú)轉(zhuǎn)染含有陰性對(duì)照shRNA的質(zhì)粒3種條件，8個(gè)蛋白分子共轉(zhuǎn)染24個(gè)細(xì)胞系。其中PDHK3-shRNA混合質(zhì)粒中3個(gè)shRNA的比例為1∶1∶1。

轉(zhuǎn)染24 h后，通過加入含有相應(yīng)抗生素的篩選培養(yǎng)基進(jìn)行CHO細(xì)胞篩選，每隔2～4 d以0.7×105～3.0×105cells/mL 的密度進(jìn)行傳代。經(jīng)過2～3周傳代，細(xì)胞活率恢復(fù)到95%以上，篩選出能夠表達(dá)目的蛋白及shRNA-PDHK3的細(xì)胞系。

1.2.4 批次補(bǔ)料實(shí)驗(yàn)及乳酸含量、抗體蛋白表達(dá)量檢測(cè)

篩選結(jié)束后，以3～7 E5密度接種搖管批次補(bǔ)料實(shí)驗(yàn)，接種后根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)行多次補(bǔ)料。Vicell細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)細(xì)胞活率、細(xì)胞密度，NoVa儀直接檢測(cè)上清液中乳酸含量。第14 d收獲上清樣品，使用HPLC檢測(cè)各個(gè)抗體蛋白分子目的蛋白的表達(dá)量。

1.2.5 PDHK3基因mRNA水平檢測(cè)

收集批次補(bǔ)料細(xì)胞沉淀，提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。針對(duì)載體PDHK3基因區(qū)域設(shè)計(jì)引物和探針，利用qPCR方法檢測(cè)PDHK3的mRNA水平。宿主CHO細(xì)胞的B2M為內(nèi)參基因，PDHK3與B2M檢測(cè)值的比值即可反映轉(zhuǎn)入shRNA-PDHK3的細(xì)胞PDHK3基因的mRNA水平的變化趨勢(shì)。

1.2.6 Neomycin基因拷貝數(shù)檢測(cè)

收集批次補(bǔ)料第0 d細(xì)胞沉淀以及批次補(bǔ)料過程第10 d的細(xì)胞沉淀，分別提取每個(gè)樣品的基因組DNA。針對(duì)載體Neomycin基因區(qū)域設(shè)計(jì)特定的引物和探針，利用ddPCR技術(shù)定量檢測(cè)Neomycin基因拷貝數(shù)，通過該基因的拷貝數(shù)間接反應(yīng)PDHK3-shRNA的基因拷貝數(shù)情況。

2 結(jié)果與討論

2.1 批次補(bǔ)料抗體蛋白表達(dá)量

在14 d左右的搖管批次補(bǔ)料實(shí)驗(yàn)中，于批次補(bǔ)料結(jié)束后收集上清液進(jìn)行HPLC_ProteinA檢測(cè)蛋白表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示共轉(zhuǎn)了PDHK3-shRNA的條件，第14 d的蛋白表達(dá)量提高了18.6%～233%，見圖1。表明抑制PDHK2基因，可以有效提高抗體蛋白表達(dá)量。

2.2 批次補(bǔ)料過程乳酸表達(dá)量

批次補(bǔ)料過程中，收集上清檢測(cè)乳酸含量的變化。實(shí)驗(yàn)組的乳酸表達(dá)量在第5～14 d表現(xiàn)出較大差別，乳酸含量在批次補(bǔ)料過程中不斷降低，而對(duì)照組乳酸含量不斷增加（除第5個(gè)分子），見圖2。

2.3 PDHK3基因的mRNA表達(dá)水平

選取兩個(gè)比較有代表性的蛋白分子進(jìn)行PDHK3基因的mRNA表達(dá)水平檢測(cè)。其中分子5是批次補(bǔ)料過程中唯一一個(gè)乳酸含量變化較小的分子，實(shí)驗(yàn)組乳酸堆積雖然相對(duì)對(duì)照組后期的乳酸較低，但并未隨著時(shí)間的推移而逐漸降低。該分子的實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于對(duì)照組的PDHK3基因的mRNA表達(dá)水平降低了76%。分子7蛋白表達(dá)水平提高了233%，是蛋白表達(dá)提高百分比最高的分子。該分子的實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于對(duì)照組的PDHK3基因的mRNA表達(dá)水平降低了65%。通過實(shí)驗(yàn)可知，抑制PDHK3基因的mRNA表達(dá)可以降低乳酸表達(dá)，同時(shí)可以提高目的蛋白產(chǎn)量。

2.4 Neomycin基因拷貝數(shù)檢測(cè)

4個(gè)分子（mAb1～mAb4）的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組2轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒中均含有Neomycin基因，拷貝數(shù)為4～9，見圖4。由拷貝數(shù)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)可知，PDHK3-shRNA在轉(zhuǎn)染過程及批次補(bǔ)料過程均有基因表達(dá)。

圖1 抗體相對(duì)表達(dá)量

圖2 乳酸表達(dá)量曲線

圖3 PDHK3基因的mRNA相對(duì)表達(dá)水平

圖4 Neomycin基因拷貝數(shù)

3 結(jié)論

將3個(gè)PDHK3-shRNA分別構(gòu)建到WuXiBio載體中，這些混合質(zhì)粒與表達(dá)不同蛋白的質(zhì)粒分別共同轉(zhuǎn)染至宿主CHO細(xì)胞中。通過對(duì)Neomycin基因拷貝數(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，構(gòu)建的PDHK3-shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染并整合到CHO細(xì)胞的基因組DNA中。而PDHK3基因的mRNA水平顯著降低且批次補(bǔ)料過程中乳酸含量降低，說明抑制PDHK3基因的表達(dá)可以降低乳酸含量。同時(shí)8個(gè)mAb實(shí)驗(yàn)組的蛋白產(chǎn)量均得到提高，推測(cè)是由于細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境如pH得到改善，更有利于細(xì)胞表達(dá)目的蛋白。

綜上所述，本研究證明通過利用shRNA方法抑制PDHK3基因的表達(dá)，不僅可以降低乳酸表達(dá)量，同時(shí)能夠提高目的蛋白的表達(dá)量。