趙詠梅,馬三平,王樂融

(西安文理學(xué)院 生物與環(huán)境工程學(xué)院，陜西 西安 710065)

高烏頭(AconitumsinomontanumNakai)為毛茛科毛茛屬植物，藥用歷史悠久中醫(yī)常以高烏頭根入藥，用以治心悸、胃氣痛、跌打損傷等癥[1]。高烏頭中主要含有二萜類生物堿，以C-18 型二萜生物堿高烏甲素居多[2]。高烏甲素化學(xué)式C32H44N2O8，分子量584.64，外觀白色晶體[3]。

高烏甲素具有較強(qiáng)的鎮(zhèn)痛作用，維持時(shí)間較長(zhǎng)，且無成癮性，不會(huì)發(fā)生蓄積中毒，臨床常以高烏甲素的氫溴酸鹽用于癌癥患者輕、中度疼痛的治療和術(shù)后痛的治療[4～6]。研究證明，腹腔注射或灌胃給予高烏甲素均能明顯提高小鼠、大鼠的痛閾，其鎮(zhèn)痛強(qiáng)度約是氨基比林的7倍，且強(qiáng)于吲哚美辛和阿司匹林，灌服給藥比注射給藥藥效明顯延長(zhǎng)[7～8]。在大鼠坐骨神經(jīng)結(jié)扎引起的神經(jīng)病理性疼痛模型上，腹腔注射4 mg·kg-1高烏甲素即可對(duì)模型鼠機(jī)械痛和熱痛產(chǎn)生顯著鎮(zhèn)痛作用，并且連續(xù)給藥3周不產(chǎn)生耐藥性[9]。然而高烏甲素用于寵物犬類的報(bào)道卻并不多。

比格犬又名“米格魯獵兔犬”，小型獵犬，一般體重7.1～9.1 kg，是目前實(shí)驗(yàn)研究中使用最多也是最標(biāo)準(zhǔn)的犬類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，被廣泛用于微生物學(xué)、病毒學(xué)、生物化學(xué)、病理學(xué)、藥理學(xué)等各類研究工作中[10]。使用比格犬作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，探究高烏甲素提取液在藥代動(dòng)力學(xué)方面的性質(zhì)，旨在為高烏甲素在大型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物內(nèi)的臨床研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料與標(biāo)準(zhǔn)品 采自河北的野生高烏頭根，取250g左右備用。經(jīng)西安鴻生生物科技有限公司測(cè)定，藥材中高烏甲素含量平均值為0.78%。98%高烏甲素標(biāo)準(zhǔn)品(成都普菲德生物技術(shù)有限公司)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 比格犬3只，由上海睿智化學(xué)研究有限公司大動(dòng)物研究中心提供，編號(hào)#1 、#2、#3 (合格證號(hào)SCXK(京)2011-0003 11400600000852)，普通級(jí)雄性，體重8.1～8.4 kg。

飼養(yǎng)條件:動(dòng)物房控制室溫范圍是20.0～26.0℃，相對(duì)濕度控制在30%～70%范圍內(nèi)，光照12 h明暗交替，動(dòng)物清洗期兩周。犬飼料購(gòu)買自北京科澳協(xié)力飼料有限公司，檢驗(yàn)合格。試驗(yàn)期間每天給予動(dòng)物飼料2次(上午和下午各1次，每次約100 g·只-1)，動(dòng)物自由攝水。

1.1.3 試劑 無水乙醇(分析醇),色譜甲醇，乙胺，EDTA-K2，純凈水，等。

1.1.4 主要儀器與設(shè)備 箱式微波干燥設(shè)備(天水華圓制藥設(shè)備科技有限公司)；循環(huán)水式真空泵(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)； 萬能高速粉碎機(jī)(上海菲力博食品機(jī)械有限公司功率: 2 300 W 轉(zhuǎn)速：25 000 r；(日本島津公司)SPD-20A高效液相色譜儀；Eppendorf 5415R型臺(tái)式低溫離心機(jī)(艾本德中國(guó)有限公司)；XW-80A漩渦混合儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；20～200 μL移液槍(Thermo)；YP100K-5型電子天平(上海良平儀器儀表有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 回流提取高烏甲素 粉碎高烏頭根，用60目篩網(wǎng)篩濾2～3次，將細(xì)粉混勻取150 g左右備用。連接好回流裝置，用75%的乙醇，以1∶10的物料比回流提取2兩次，每次回流2 h。

回流結(jié)束后取出蒸餾燒瓶冷卻至室溫，而后真空抽濾，濃縮，真空干燥8 min，得到粗提物，將其研磨成細(xì)粉裝入自封袋中，待測(cè)。

1.2.2 提取物中高烏甲素含量的測(cè)定 精確稱量樣品10.0 mg倒入100 mL容量瓶中，加20 mL甲醇(色譜醇)，超聲溶解，冷卻至室溫，用甲醇(色譜醇)定容，搖勻備用。高效液相色譜檢測(cè)條件為，色譜柱:Phenomenex C18柱( 150 mm ×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：色譜甲醇(0.1 mol·L-1NaH2PO4)=72∶28(V/V)；檢測(cè)波長(zhǎng):254 nm；柱溫：30℃；流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量20 μL；檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)：30 min。

樣品計(jì)算方法：樣品含量=(樣品峰面積×對(duì)照濃度)/(對(duì)照峰面積×樣品濃度)×100%×對(duì)照含量。

1.2.3 動(dòng)物樣品采集及處理 參考高烏甲素在人體內(nèi)的用量，以不同物種、大小動(dòng)物體表面積系數(shù)為依據(jù)，近似推算，選用劑量0.5 mg·kg-1。從靜脈近心端使血管突起處給藥2.03、2.05、2.11 mL[11]。采集給藥前(0h)，給藥后0.083 h(5 min)、0.25 h、0.5 h、1 h、2 h、4 h、8 h、24 h時(shí)間點(diǎn)血液各0.5 mL，采集位置為比格犬未給藥的前肢橈靜脈。將采集到的血液轉(zhuǎn)移到上述準(zhǔn)備的離心管中，震蕩倒置至血液與15%EDTA-K2抗凝劑混合均勻。低溫離心機(jī)4℃、3 000 g離心5 min，吸取上清液200 uL，轉(zhuǎn)移至血漿收集離心管中，干冰-79℃冷凍保存，等待分析。

1.2.4 樣品檢測(cè)及數(shù)據(jù)分析 血藥樣品由上海睿智化學(xué)研究有限公司進(jìn)行檢測(cè)，使用WinNonlin 6.2藥學(xué)分析軟件進(jìn)行分析，對(duì)得到的血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)，分別使用房室模型及非房室模型進(jìn)行分析[12]。

2 結(jié)果

2.1 高烏甲素液相色譜結(jié)果

高烏頭細(xì)粉以75%乙醇為提取液，經(jīng)回流提取濃縮干燥后，得到樣品。經(jīng)液相色譜檢測(cè)，得到圖1和圖2。高烏甲素標(biāo)品的液相色譜最高峰出現(xiàn)在11.932 min，峰面積為1 057 900.250(圖1)；高烏甲素實(shí)驗(yàn)樣品最高峰出現(xiàn)在11.798 min，峰面積為172 396.000(圖2)。經(jīng)計(jì)算，樣品高烏甲素含量為4.21 mg·g-1。

圖1 高烏甲素標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)

圖2 高烏甲素實(shí)驗(yàn)樣品檢測(cè)

2.2 比格犬血藥濃度-時(shí)間曲線

通過對(duì)比格犬0 min，5 min，15 min，30 min，1 h，2 h，4 h，8 h，24 h的血漿樣品進(jìn)行分析，得到結(jié)果如下：

表1 比格犬各時(shí)間點(diǎn)血藥濃度

圖3 比格犬血藥濃度-時(shí)間

2.3 房室模型計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

藥物在體內(nèi)代謝的動(dòng)態(tài)變化過程一般相當(dāng)復(fù)雜，故為方便研究必須將復(fù)雜的機(jī)體系統(tǒng)進(jìn)行簡(jiǎn)化，就是通過建立簡(jiǎn)化的模型，再用相應(yīng)相關(guān)數(shù)學(xué)公式進(jìn)行具體的描述。在這種模型中機(jī)體被視為一個(gè)系統(tǒng)，并按照各組織器官等不同的動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)劃分為若干個(gè)隔室，因而稱其為隔室模型。每種隔室將機(jī)體內(nèi)代謝速率相同或近似的器官、組織歸為一類，進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)計(jì)算。一般常用的有一室模型和二室模型。

對(duì)三只比格犬的血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)分別以一室模型、二室模型進(jìn)行擬合，使用AIC方法(AIC，Akaike Information Cterion，是衡量統(tǒng)計(jì)模型擬合優(yōu)良性的一種標(biāo)準(zhǔn)，值越小則擬合程度越高)判斷擬合度。一室模型AIC值分別為62.45069、67.85479、61.75113，二室模型AIC值分別為53.46675、22.10481、42.39236，二室模型AIC值顯著低于一室模型，因而選用二室模型進(jìn)行分析。

表2 二室模型下比格犬藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

AUC(area under the time concentration curve，AUC，曲線下分布面積)，K10-HF(K10，從中間室消除的表觀一級(jí)速率常數(shù)，K10-HF，中間室消除半衰期)，Alpha(fast disposition rate constant，α，二室模型中描述藥物在體內(nèi)分布的表觀一級(jí)混合速率常數(shù))，Beta(slow disposition rate constant，β，二室模型中描述藥物消除的表觀一級(jí)混合速率常數(shù))，Alpha_HL(分布相的半衰期)，Beta_HL(消除相的半衰期)，Cmax(按模型推算出的給藥后的最大血藥濃度)，CL(清除率，單位時(shí)間內(nèi)清除藥物的血漿容積)，AUMC(一階矩，時(shí)間和血藥濃度的乘積與時(shí)間曲線的下面積)，MRT(Mean Residence Time， MRT，平均滯留時(shí)間)，Vss(表觀穩(wěn)態(tài)分布容積)，CLD(血漿藥物透析清除率)。經(jīng)檢測(cè)，公式參數(shù)分別為：α=4.935±0.896，β=0.213±0.022，A=113.623±74.279，B=83.267±71.9593。

經(jīng)計(jì)算，平均藥代動(dòng)力學(xué)公式為

C=98.925205e^(-4.038817*t)+79.244653e^(-0.234683*t)

2.4 非房室模型計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

非房室模型在計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)時(shí)不依賴于隔室模型，而是以藥物濃度-時(shí)間曲線下面積作為主要計(jì)算依據(jù)，不受數(shù)學(xué)模型的限制，故又稱為非隔室分析法(nonconpartment analysis)。該方法計(jì)算簡(jiǎn)便，且適用于緩控釋制劑的藥代動(dòng)力學(xué)研究。計(jì)算得到參數(shù)如下：

表3 非房室模型下比格犬藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

HL_Lambda_z( half-life，HL，血漿半衰期)：藥物在血漿中最高濃度降低一半所需的時(shí)間。不同藥物的HF相差很大，一般常用的藥物按照HF的長(zhǎng)短可以分為5類，超快速消除類(HF≤1 h，如青霉素，甲氧西林、萘夫西林等)、快速消除類(HF=1～4 h，如氨芐西林，頭孢唑林，克林霉素等)、中速消除類(HF=4～8 h，如林可霉素，土霉素、丙磺舒等)、慢速消除類(HF=8～24 h，如多西環(huán)素、美他環(huán)素、磺胺嘧啶等)以及超慢速消除類(HF>24 h)。

AUC(area under the time concentration curve，AUC，曲線下分布面積)，AUClast指的從給藥時(shí)間開始到最后一個(gè)點(diǎn)的這段時(shí)間的AUC，均值為354 ± 37.6 h*ng·mL-1，AUCINF_obs指的從給藥開始到理論外推無窮遠(yuǎn)的時(shí)間的AUC)：代表著被吸收到體內(nèi)的總藥量，均值為430 ± 42.7 h*ng·mL-1。Vss(total volume of distribution，分布容積)：當(dāng)血漿和組織內(nèi)藥物分布達(dá)到平衡后，體內(nèi)藥物按此時(shí)的血漿藥物濃度在體內(nèi)分布所需要的體液容積，實(shí)驗(yàn)測(cè)得Vss均值為5.13±0.560 L·kg-1。

3 討論

高烏甲素因其有強(qiáng)效鎮(zhèn)痛，降溫抗炎，增強(qiáng)人體免疫力，不會(huì)成癮，沒有致突變和致癌風(fēng)險(xiǎn)等特點(diǎn)，在醫(yī)藥學(xué)方面有著非常重要的作用。而關(guān)于高烏甲素的鎮(zhèn)痛機(jī)制研究較多，但說法不一。有研究認(rèn)為高烏甲素參與阻斷電壓門控的鈉離子通道，通過減少鈉離子內(nèi)流并阻斷延遲性鉀離子內(nèi)流，來抑制動(dòng)作電位的產(chǎn)生而起到鎮(zhèn)痛作用[13～14]。還有一些報(bào)道認(rèn)為高烏甲素的鎮(zhèn)痛作用與甲腎上腺素和五羥色胺下行抑制系統(tǒng)有關(guān)[15～17]。關(guān)于高烏甲素在動(dòng)物體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究，目前的研究多集中于大鼠和小鼠[18]，而在大型動(dòng)物體內(nèi)的研究還較少。

在筆者實(shí)驗(yàn)中，按照非房室模型數(shù)據(jù)，比格犬靜脈注射高烏甲素提取液0.5 mg·kg-1，分布容積Vss為5.13 ± 0.560 L·kg-1，理論上藥物全部進(jìn)入血液中，Vss約為0.1L·kg-1，大于此值，即代表相對(duì)血藥濃度越低，藥物可能在某些器官組織中有富集，得值遠(yuǎn)大于0.1 L·kg-1，即代表此藥物在器官內(nèi)有明顯的富集現(xiàn)象，而具體在哪些器官中富集，仍需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探究。AUClast和AUCINF分別為354 ± 37.6和 430 ± 42.7 h·ng-1·mL-1，以此為參照，可以計(jì)算同等劑量其他給藥方式的生物利用度F。MRTlast和MRTINF_obs分別為2.586±0.05529和4.38175±0.127。半衰期HF為 3.31 ± 0.155 h，代謝速度屬于快速消除，藥效時(shí)間相對(duì)較短，作為鎮(zhèn)痛藥品，可能難以滿足寵物犬的臨床使用。但因?yàn)槭茄軆?nèi)途徑給藥，藥物直接進(jìn)入血液，沒有吸收過程，所以應(yīng)考慮其他吸收較慢的給藥方式，如皮下注射、肌肉注射或靜脈滴注等，或考慮其他劑型如載體制劑、緩控釋制劑等，增加半衰期HF，提高有效血藥濃度時(shí)間。

比格犬靜脈注射高烏甲素0.5mg·kg-1，按照二房室模型數(shù)據(jù)，公式參數(shù)分別為：α=4.935±0.896，β=0.213±0.022，A=113.623±74.279，B=83.267±71.9593，以此模型可以為其他相關(guān)研究提供參考。