葉錦培　李曉麗　唐世斌　嚴(yán)壯洧　陳仕香　劉海梅　黃愛(ài)萍

摘要：為探討鋁脅迫時(shí)六堡茶的生理生化變化，進(jìn)而為六堡茶選育栽培和產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供參考，本研究以六堡茶苗為材料，在溶液pH值為4條件下，設(shè)計(jì)0（CK）、50（T1）、100（T2）、200（T3）、400 mg/L（T4）的鋁濃度進(jìn)行水培處理，并于30 d后測(cè)定葉片中MDA含量和CAT、SOD、POD活性，以及DNA甲基化水平。結(jié)果表明：隨著鋁濃度增大，六堡茶苗的MDA含量呈先升高后降低再升高的趨勢(shì)，T3處理的MDA含量最低，與CK差異顯著，T1處理則略高于CK，但差異不顯著;CAT活性表現(xiàn)為先降低再升高后降低再升高趨勢(shì)，T2處理的CAT活性最高，是CK的2.76倍，其它處理則與CK無(wú)顯著差異;SOD活性呈先升高后降低再升高再降低趨勢(shì)，與CK相比，T3處理的SOD活性升高12.69%，與對(duì)照差異顯著，其它處理則與對(duì)照無(wú)顯著差異;POD活性表現(xiàn)為先降低再升高再降低趨勢(shì)，T3處理的POD活性最大，T1處理最小，均與CK差異顯著;DNA甲基化水平表現(xiàn)為先升高后降低趨勢(shì)，T3處理的5-甲基胞嘧啶含量最高。

關(guān)鍵詞：六堡茶;鋁濃度;抗性生理;DNA甲基化

中圖分類號(hào)：S571.101文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2020）04-0112-05

Abstract This study was aimed to explore the physiological and biochemical changes of Liupao tea under aluminum stress， and provide references for its breeding and industry development. The seedings of Liupao tea were used as meterials， and the aluminum concentrations of 0 （CK）， 50 mg/L （T1）， 100 mg/L （T2）， 200 mg/L （T3） and 400 mg/L （T4） were designed for hydroponics treatment at pH value of 4. The MDA content， the activities of CAT， SOD and POD and the DNA methylation level in leaves were determined after hydroponics for 30 days. The results showed that with the increase of aluminum concentration， the MDA content of Liupao tea seedlings increased first， then decreased， and increased again. Under T3 treatment， the MDA content was the lowest and significantly different from that of CK. The MDA content of T1 treatment was slightly higher than that of CK， and the difference was not significant. The CAT activity showed a decresing-increasing-decreasing-increasing trend with the increase of aluminum concentration. The CAT activity of T2 treatment was the highest as 2.76 times that of CK， while the other treatments had no significant difference with CK. The change of SOD activity showed a increasing-decreasing-increasing-decreasing trend. The SOD activity was the highest under T3 treatment， which increased by 12.69% and was significantly higher than that of CK. There was no significant difference between the other treatments and CK. The POD activity changed as decreasing-increasing-decreasing. The POD activity was the highest under T3 treatment and the lowest under T1 treatment， which were both significantly different from that of CK. The DNA methylation level firstly increased and then decreased， and the content of 5-methylcystein was the highest under T3 treatment.

Keywords Liupao Tea; Aluminum concentration; Resistance physiology; DNA Methylation

鋁（Al）是地殼中含量最豐富的金屬元素，自然界中分布廣泛。地殼中鋁主要以氧化鋁或難溶的硅酸鹽等形式存在，對(duì)植物無(wú)害，但在酸性條件下（pH<5），一些固定態(tài)鋁會(huì)被活化為可溶性鋁（主要為Al3+）而進(jìn)入土壤，對(duì)多數(shù)植物產(chǎn)生毒害。

茶樹(shù)是一類富鋁植物，鋁含量明顯高于其它植物[1，2]，其葉片中鋁含量最高，根中次之，莖中最低[3]。六堡茶為全國(guó)二十四名茶之一。近年來(lái)，伴隨黑茶消費(fèi)熱潮的形成，六堡茶的年產(chǎn)量和出口量均出現(xiàn)快速增長(zhǎng)。六堡茶原產(chǎn)地廣西壯族自治區(qū)梧州市蒼梧縣，土壤類型以赤紅壤為主，呈酸性，交換性鋁占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。但被活化的可溶性鋁如何影響六堡茶的生長(zhǎng)和品質(zhì)尚不清楚。因此探討六堡茶的鋁抗性以及鋁脅迫時(shí)的生理生化變化，對(duì)于其選育和栽培乃至產(chǎn)業(yè)的發(fā)展有重要意義。本研究在不同鋁環(huán)境下對(duì)六堡茶苗進(jìn)行水培，分析茶苗的抗氧化酶活性和DNA甲基化水平差異，以期了解該茶的抗鋁機(jī)理，并為其耐鋁種質(zhì)資源的選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試材選自廣西壯族自治區(qū)蒼梧縣國(guó)有天洪嶺林場(chǎng)六堡茶六堡群體種（蒼梧縣六堡鎮(zhèn)的茶樹(shù)群體種）扦插苗，茶苗長(zhǎng)勢(shì)大體一致（苗高約30 cm）。

1.2 試驗(yàn)處理

將茶苗根系土壤洗凈，移入盛有1 L 1/2Hoagland營(yíng)養(yǎng)液水桶中水培，茶苗適應(yīng)期間每周更換營(yíng)養(yǎng)液。30 d后對(duì)茶苗進(jìn)行鋁脅迫，具體步驟為：將不同量的Al2（SO4）3加至1/2Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中，分別使鋁處理濃度達(dá)到0（CK）、50（T1）、100（T2）、200 mg/L（T3）和400 mg/L（T4），溶液pH值調(diào)整為4。每處理重復(fù)3次，每重復(fù)11株茶苗。每周更換一次營(yíng)養(yǎng)液，營(yíng)養(yǎng)液用量為1 L。處理30 d后采集枝條頂部2～3片新生嫩葉和芽，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 茶苗葉片抗性生理指標(biāo)測(cè)定

丙二醛（MDA）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）和過(guò)氧化物酶（POD）均使用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行提取。MDA含量測(cè)定采用TBA法，CAT、POD活性測(cè)定采用可見(jiàn)光法，SOD活性測(cè)定采用羥胺法。

1.4 茶苗葉片DNA甲基化水平測(cè)定

1.4.1 DNA待測(cè)液的制備 采用新型植物基因組DNA試劑盒（康為世紀(jì)生物科技有限公司產(chǎn)品）提取茶苗葉片DNA，保存于-20℃?zhèn)溆?。取DNA提取待測(cè)液10 μL，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定A260和A280，以A260估算DNA產(chǎn)率，A260/A280判斷樣品DNA純度。

1.4.2 5-甲基胞嘧啶和胞嘧啶含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 參照黑淑梅[4]的方法測(cè)定5-甲基胞嘧啶和胞嘧啶含量。將50 mg胞嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品溶解于500 μL的TE緩沖液中，再取0.75 μL上述溶液于1.5?mL TE緩沖液中混勻，即得濃度為50 μg/μL的胞嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品溶液。5-甲基胞嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品溶液也以相同方式制備。試驗(yàn)用色譜柱為Hypersil BDS-C18鍵合柱（5 μm，150×46 mmI.D.）;流動(dòng)相組分包括5%甲醇、4.75 mmol/L己烷磺酸鈉和0.2%三乙醇胺，流動(dòng)相用娃哈哈純凈水配制，再用磷酸調(diào)至pH值為5.5;流速：0.7 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)：273 nm;進(jìn)樣量：10 μL;運(yùn)行時(shí)間：15 min。胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣量分別為2、4、6、8 μL和10 μL，對(duì)應(yīng)濃度分別為10、20、30、40 μg/μL和50 μg/μL。

1.4.3 5-甲基胞嘧啶含量的測(cè)定 配制2 mol/L HCl溶液和4 mol/L NaOH溶液各1 L;取20 μL DNA于1.5 mL離心管中，加入20 μL 2 mol/L HCl，恒溫水浴鍋中80℃水解120 min;離心管中加入4 mol/L NaOH 20 μL以中和多余HCl，4 000 r/min離心1 min;吸取上清液于新離心管中待測(cè)。

葉片DNA的胞嘧啶（C）和5-甲基胞嘧啶（5-MeC）的含量使用外標(biāo)準(zhǔn)法計(jì)算。先比較樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積，再根據(jù)公式[5-MeC/（C+5-MeC）]×100%計(jì)算5-MeC的百分含量。

1.5 數(shù)據(jù)分析

利用Microsoft Excel 2007軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鋁對(duì)六堡茶苗抗性生理的影響

2.1.1 MDA含量 由圖1可以看出，隨鋁濃度增大，葉片MDA含量呈現(xiàn)先升高后降低再升高的趨勢(shì)。與CK相比，T2、T3和T4處理的MDA含量分別下降21.29%、66.91%和23.75%，差異顯著（P<0.05），T1處理則升高5.36%，差異不顯著（P>0.05）。

柱上不同小寫字母表示0.05水平差異顯著，下同。

2.1.2 CAT活性 由圖2可以看出，隨鋁濃度增大，葉片CAT活性表現(xiàn)為先降低再升高再降低再升高。T2處理的CAT活性最高，是CK的2.76倍，差異顯著;T4處理比CK升高12.89%，差異不顯著;而T1、T3處理均低于CK，且T1與CK差異達(dá)顯著水平。

2.1.3 SOD活性 由圖3可以看出，隨鋁濃度增大，葉片SOD活性表現(xiàn)為先升高后降低再升高再降低。與CK相比，T1和T3處理的SOD活性分別上升7.61%和12.69%，其中T3與CK差異達(dá)顯著水平;T2和T4處理的SOD活性則分別降低2.03%和7.11%，差異均不顯著。

2.1.4 POD活性 由圖4可以看出，隨鋁濃度增大，葉片POD活性呈現(xiàn)先降低再升高再降低的趨勢(shì)。與CK相比，T3和T4處理的POD活性分別升高83.33%和33.33%，差異顯著，而T1和T2處理則分別降低61.11%和50.00%。

2.2 鋁對(duì)六堡茶苗DNA 5-甲基化的影響

本研究以濃度（μg/μL）為橫坐標(biāo)，峰面積（×10000）為縱坐標(biāo)分別繪制標(biāo)準(zhǔn)品胞嘧啶和標(biāo)準(zhǔn)品5-甲基胞嘧啶的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可得，胞嘧啶的線性方程：y=12590x+3212，R2=0.9996（圖5）;5-甲基胞嘧啶線性方程：y=37715x-16156，R2=0.9996（圖6）;胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶均在0～50 μg/μL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，可用于后續(xù)胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶含量的計(jì)算。

由圖7可以看出，六堡茶葉片5-甲基胞嘧啶含量隨鋁濃度的升高表現(xiàn)為先升高后降低，具體表現(xiàn)為0～200 mg/L鋁濃度范圍內(nèi)，5-甲基胞嘧啶含量逐漸上升，并于200 mg/L時(shí)達(dá)到最高值26.92%，之后略有降低。與CK相比，T1、T2、T3和T4處理的葉片5-甲基胞嘧啶含量分別提高56.84%、110.95%、175.10%和153.27%，差異顯著。

3 討論與結(jié)論

3.1 鋁脅迫對(duì)六堡茶苗抗性生理的影響

阮建云等[5]通過(guò)對(duì)茶園土與自然土的pH值和交換性鋁、鎂、鈣含量進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，茶園土的pH值明顯低于自然土，土壤交換鋁含量明顯高于自然土，說(shuō)明種茶會(huì)使土壤酸化，而低pH值有利于交換性鋁在茶園土壤中積累。適量的鋁可以促進(jìn)茶樹(shù)生長(zhǎng)，且有利于提高茶葉的化學(xué)品質(zhì)成分。羅亮等[6]認(rèn)為鋁濃度大于50 mg/L會(huì)對(duì)茶樹(shù)生長(zhǎng)產(chǎn)生毒害作用，但不同品種對(duì)鋁的反應(yīng)存在差異。

植物生長(zhǎng)過(guò)程中可能會(huì)遭受各種生物和非生物脅迫。當(dāng)處于逆境時(shí)，植物體內(nèi)的活性氧會(huì)大量積累，導(dǎo)致其不能正常生長(zhǎng)，甚至死亡。但植物體內(nèi)的保護(hù)酶CAT、SOD、POD等可以清除過(guò)量的活性氧，在植物抗逆性方面發(fā)揮重要作用。本研究中，與對(duì)照相比，50 mg/L鋁處理的葉片SOD活性升高7.61%，POD和CAT活性分別降低61.11%、52.89%，MDA含量升高5.36%;100 mg/L鋁處理的葉片SOD和POD活性分別降低2.03%、50.00%，CAT活性升高276.44%，MDA含量降低21.29%;200 mg/L鋁處理的葉片SOD和POD活性分別升高12.69%、83.33%，CAT活性降低34.67%，MDA含量降低66.91%;400 mg/L鋁處理的葉片SOD活性降低7.11%，而POD和CAT活性分別升高33.33%、12.89%，MDA含量降低23.75%。因此，除200 mg/L鋁處理外，其它處理對(duì)六堡茶葉片SOD活性的促進(jìn)作用不大;100 mg/L鋁處理對(duì)CAT活性、

200 mg/L對(duì)POD活性的促進(jìn)作用明顯，并與其它處理間存在明顯差異，因而六堡茶葉片SOD對(duì)鋁脅迫的反應(yīng)程度弱于POD和CAT，推測(cè)POD可能是消除鋁脅迫產(chǎn)生的過(guò)量活性氧的主要酶，而CAT的清除作用稍弱于POD。

本研究中，試驗(yàn)所設(shè)4個(gè)鋁處理濃度均對(duì)六堡茶苗的抗性生理有不同程度的影響，但與羅亮[6]、王敏[7]等對(duì)雁蕩毛峰、知仁早茶、龍井43茶籽苗等茶葉品種的研究結(jié)果相比，規(guī)律性稍差。為此，課題組從整個(gè)試驗(yàn)進(jìn)程進(jìn)行必要追溯，認(rèn)為試驗(yàn)操作、測(cè)定重復(fù)及精度滿足規(guī)定要求，猜測(cè)可能是由于六堡茶六堡群體種特性不同于其它茶樹(shù)品種所致或是由其它原因造成，需待進(jìn)一步研究求證。

3.2 鋁脅迫對(duì)六堡茶苗DNA甲基化水平的影響

DNA甲基化是植物生長(zhǎng)發(fā)育中普遍存在的一種現(xiàn)象。甲基化修飾在植物基因表達(dá)、防御以及生長(zhǎng)發(fā)育中起調(diào)節(jié)作用，可以影響植物開(kāi)花、花及葉的形態(tài)等。黑淑梅[4]研究表明，Cr6+可導(dǎo)致小麥體內(nèi)的活性氧濃度升高，高濃度活性氧條件下甲基自由基產(chǎn)生量升高，甲基自由基會(huì)與DNA中的胞嘧啶形成5-甲基胞嘧啶，從而提高DNA甲基化水平。王子成[8]、Kimatu[9]等認(rèn)為植物體內(nèi)甲基化的建立和維持需要染色體DNA甲基轉(zhuǎn)移酶等參與，而DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的活性受細(xì)胞內(nèi)金屬離子濃度的影響，金屬離子濃度過(guò)高，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的活性會(huì)受到抑制，從而造成DNA中胞嘧啶合成5-甲基胞嘧啶的速率下降。本研究中，鋁脅迫下的六堡茶苗葉片5-甲基胞嘧啶含量均高于對(duì)照，并在200 mg/L時(shí)達(dá)到最高，400 mg/L時(shí)略有下降。這可能是鋁脅迫導(dǎo)致六堡茶體內(nèi)活性氧濃度升高，甲基自由基產(chǎn)生加快，從而促進(jìn)DNA中5-甲基胞嘧啶的合成，進(jìn)而提高DNA甲基化水平，但過(guò)高的鋁濃度抑制5-甲基胞嘧啶甲基轉(zhuǎn)移酶的活性，并且該抑制過(guò)程不可逆，因而出現(xiàn)一定程度的下降。

綜上所述，鋁脅迫不僅能夠改變六堡茶苗葉片保護(hù)酶活性，還能造成葉片DNA的損傷，引起甲基化水平改變。本研究結(jié)果可為六堡茶種質(zhì)資源選擇和了解其抗鋁脅迫機(jī)理提供參考。

參 考 文 獻(xiàn)：

[1] 王登良，張均偉，龍志榮，等. 六堡茶加工工藝探討[J]. 廣東茶業(yè)，2009（6）：36-38.

[2] 左小博，蘇小琴，孔俊豪，等. 六堡黑茶浸提工藝優(yōu)化及固體飲料開(kāi)發(fā)[J]. 食品工業(yè)科技，2018，39（11）：177-182.

[3] 曹中環(huán)，邱瑞瑾，王登良，等. 六堡茶加工過(guò)程中主要生化成分的變化[J]. 廣東茶業(yè)，2016（3）：26-28.

[4] 黑淑梅. 重金屬鉻對(duì)小麥根系DNA甲基化水平的影響[J]. 吉林農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，37（2）：14-15，26.

[5] 阮建云，王國(guó)慶，石元值，等. 茶園土壤鋁動(dòng)態(tài)及茶樹(shù)鋁吸收特性[J]. 茶葉科學(xué)，2003，23（增）：16-20.

[6] 羅亮，謝忠雷，劉鵬，等. 茶樹(shù)對(duì)鋁毒生理響應(yīng)的研究[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2006，25（2）：305-308.

[7] 王敏. 茶樹(shù)對(duì)鋁的生理響應(yīng)與固定累積研究[D]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2017.

[8] 王子成，馬洪霞，何艷霞. 重金屬鎘對(duì)擬南芥DNA甲基化的影響[J]. 植物生理學(xué)通訊，2009，45（2）：115-118.

[9] Kimatu J N. 鋁脅迫誘導(dǎo)玉米DNA甲基化變異及其與鋁毒性耐性基因型間差異的可能關(guān)系研究[D]. 長(zhǎng)春：東北師范大學(xué)，2010.