李瑋 宋國琦 李玉蓮 張淑娟 張榮志 高潔 李吉虎 李根英

摘要：為了明確直擴PCR在小麥多效抗病基因檢測中的效果，促進(jìn)廉價、快捷的直擴PCR技術(shù)在小麥分子育種中的應(yīng)用，本研究通過對聚合三個多效抗病基因Sr2、Lr34、Lr67的BC2單株進(jìn)行直擴PCR檢測，篩選到了三個基因聚合的雜合單株，證明了直擴PCR的有效性，并討論了直擴PCR的優(yōu)缺點和影響因素，為直擴PCR技術(shù)在作物分子育種中的推廣應(yīng)用提供參考。

關(guān)鍵詞：小麥;直擴PCR試劑盒;多效抗病基因;分子標(biāo)記

中圖分類號：S512.1：Q781 ?文獻(xiàn)標(biāo)識號：A ?文章編號：1001-4942（2020）02-0015-04

Abstract To clarify the effect of direct PCR in detecting pleiotropic disease resistant genes in wheat， and promote the utilization of inexpensive and rapid direct PCR technology in wheat molecular breeding， the BC2 progeny were detected by direct PCR. The results showed that the heterogeneous individuals with three pleiotropic disease resistant genes Sr2， Lr34 and Lr67 were selected by direct PCR which indicated the effectiveness of direct PCR. The advantages， disadvantages and impact factors of direct PCR were also discussed. This study would provide references for popularization and application of direct PCR in crop molecular breeding.

Keywords Wheat; Direct PCR kit; Pleiotropic disease resistant gene; Molecular marker

小麥?zhǔn)俏覈谌蠹Z食作物，條銹病、葉銹病、稈銹病和白粉病是小麥生產(chǎn)中的重要病害，多效抗病基因?qū)︿P病和白粉病均有持久抗性，主要有Lr34/Yr18/Pm38/Sr57[1]、Lr27/Yr30/Sr2[2]、Lr46/Yr29/Pm39/Sr58[3]和Lr67/Yr46/Pm46/Sr55[4]。利用分子標(biāo)記輔助將多效抗病基因?qū)雰?yōu)良品種培育抗病品種是防治病害經(jīng)濟有效的途徑。開展分子標(biāo)記輔助選擇育種需要提取DNA進(jìn)行分子標(biāo)記檢測，常用的DNA提取方法主要是CTAB法[5]和SDS法[6]，這兩種方法都需要經(jīng)過組織破碎、細(xì)胞裂解、蛋白沉淀、DNA洗鹽和重新溶解等多個步驟，不但費時費力，而且DNA提取質(zhì)量和數(shù)量不能保證。傳統(tǒng)的DNA提取方法耗時耗力，已成為分子標(biāo)記檢測的限速步驟。

隨著研究的深入，科研人員發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致PCR失敗的主要原因不是模板不足，而是PCR抑制因子太多[7]。通過改變DNA提取策略，使用極少量組織樣品或稀釋粗提液作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)（即直擴PCR）被提出并在法醫(yī)檢測中成功應(yīng)用[8]。在植物方面，Berthomieu等最早在煙草中使用藍(lán)槍頭（1 mL）或黃槍頭（200 μL）穿刺葉片和根獲得少量組織碎片，加入100 μL PCR反應(yīng)體系中獲得了直擴PCR成功[9];Rogers等用白槍頭（10 μL）擠壓葉片獲得小葉盤，加入50 μL PCR反應(yīng)液中進(jìn)行擴增，也獲得了成功[7]。Collard等比較了6種從水稻葉片中提取DNA的方法，發(fā)現(xiàn)堿法（以NaOH溶液為提取液）和傳統(tǒng)SDS法提取DNA的PCR擴增效果相當(dāng)[10]。在小麥中，He等對Pm21進(jìn)行基因定位時，采用TE煮沸法獲得粗提DNA直接進(jìn)行PCR反應(yīng)，也取得較好的效果[11]。

直擴PCR減少了繁瑣的DNA提取步驟，操作簡便，省時省力，特別適用于對大量個體的分子標(biāo)記檢測，是簡便快捷的可選方法。鑒于直擴PCR在小麥中應(yīng)用較少，為了明確直擴PCR在小麥分子育種中的效果，本研究利用直擴試劑盒對聚合三個多效抗病基因（Sr2/Lr34/Lr67）的小麥BC2單株進(jìn)行分子標(biāo)記檢測，成功篩選到同時含有三種基因的雜合單株，可為自交創(chuàng)制多效抗病基因聚合新種質(zhì)提供材料，并為促進(jìn)直擴PCR的廣泛應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究所用小麥材料為Pavon76（含Sr2）、中國春（含Lr34）、NP876（含Lr67）和濟麥229復(fù)交聚合三個多效抗病基因然后用濟麥229回交的BC2單株。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA粗提液準(zhǔn)備 參考T5植物直擴試劑盒（擎科，青島）說明書中的加熱裂解法處理樣品。取苗期小麥葉片，剪取4 mm×2 mm大小放入1.5 mL離心管中，加入50 μL buffer A，用黃槍頭搗幾下使溶液變綠，95℃溫浴10 min，加入等體積buffer B，混勻后取上清1 μL作模板。

1.2.2 引物 試劑盒提供陽性對照引物rbcLa-F（5′-ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC-3′）和rbcLa-R（5′-GAAACGGTCTCTCCAACGCAT-3′），用于擴增維管植物rbcL基因650 bp片段。選用cssfr1檢測Lr34[12]。選用csSr2檢測Sr2[13]，由于csSr2引物組合擴增不穩(wěn)定，用DNAMAN8設(shè)計引物Sr2-637R（5′-CCCTGCTATCATCATAATCAGTC-3′）與原引物csSr2F組合進(jìn)行檢測。TM4是Lr67的KASP標(biāo)記[14]，利用dCAPS Finder 2.0[15]將TM4轉(zhuǎn)換成dCAPS標(biāo)記TM4dcaps，用于檢測Lr67。

1.2.3 直擴PCR 采用10 μL體系，包含2×T5直擴酶Mix 5 μL，10 μmol·L-1上下游引物各0.5 μL（擎科，青島），DNA粗提液1 μL，去離子水3 μL。利用384孔PCR儀Veriti（AB，美國）進(jìn)行PCR，程序為：98℃ 3 min; 98℃ 10 s，退火10 s（退火溫度：陽性對照64℃，cssfr1 58℃，csSr2 62℃，TM4dcaps 53℃），72℃ 10 s，40個循環(huán);最后72℃ 3 min。

1.2.4 酶切反應(yīng) 取5 μL dCAPS標(biāo)記擴增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴增成功的加入1×buffer R 1 μL，HinfⅠ（10 U·μL-1）1 μL，去離子水3 μL，混勻后37℃溫浴1 h。

1.2.5 產(chǎn)物檢測 PCR產(chǎn)物或酶切產(chǎn)物用1.5%～2.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，GoldView Ⅱ型核酸染料（索萊寶，北京）染色，Universal Hood Ⅱ（Bio-Rad，美國）拍照。PCR產(chǎn)物檢測用Marker DL2000（六條帶從大到小依次為2 000、1 000、750、500、250、100 bp），酶切產(chǎn)物檢測用50 bp DNA Ladder（八條帶從大到小依次為500、400、300、250、200、150、100、50 bp）。

2 結(jié)果與分析

2.1 陽性對照檢測結(jié)果

在獲得DNA粗提液后，首先利用試劑盒提供的陽性對照引物進(jìn)行檢測，從結(jié)果（圖1）可見，所有個體均能擴增出650 bp條帶，說明粗提液可以用于后續(xù)實驗檢測。

2.2 Lr34檢測結(jié)果

Lr34的分子標(biāo)記cssfr1是一個顯性標(biāo)記，含有該基因的單株可擴增出517 bp條帶，而不含該基因的單株無該條帶（圖2）。在本研究中，BC1代時用隱性純和親本濟麥229對雜合型個體進(jìn)行了回交，BC2個體能擴增出517 bp條帶即表明其為雜合型單株（下同）。擴增條帶的強弱可能與DNA粗提液的質(zhì)量有關(guān)。

2.3 Sr2檢測結(jié)果

csSr2是CAPS標(biāo)記，有三種檢測結(jié)果：無擴增（不含Sr2），有擴增但不能酶切（不含Sr2），有擴增可以酶切（含有Sr2）。在本研究中，由于僅供體親本Pavon76含有Sr2，其他親本均無，所以至BC2時，僅通過有無擴增產(chǎn)物即可判斷是否含有Sr2，不需要進(jìn)行酶切。含有Sr2的單株（雜合型）可擴增出484 bp條帶，不含Sr2的單株無擴增（圖3）。

2.4 Lr67檢測結(jié)果

TM4dcaps擴增產(chǎn)物385 bp（圖4），用HinfⅠ酶切后，不含Lr67的單株產(chǎn)生329 bp條帶，含有Lr67的單株不酶切，雜合型單株同時含有385 bp和329 bp兩條帶（圖5）。

2.5 三個多效抗病基因的篩選結(jié)果

通過上述直擴PCR篩選，我們從8個BC2單株中篩選到了同時含有Lr34、Sr2和Lr67三個多效抗病基因的雜合單株1和3，成功篩選出目標(biāo)。

3 討論

多效抗病基因是小麥寶貴的基因資源，利用分子標(biāo)記輔助選擇進(jìn)行回交轉(zhuǎn)育是利用這些寶貴資源的有效手段。直擴PCR作為一種分子標(biāo)記檢測策略，已經(jīng)在法醫(yī)數(shù)據(jù)庫建設(shè)中得到了廣泛應(yīng)用[16]，將其用于小麥分子育種有助于改善當(dāng)前分子標(biāo)記檢測成本較高、耗時費力的現(xiàn)狀。與傳統(tǒng)的CTAB或SDS提取方法相比，直擴PCR采用DNA粗提液作為模板，其突出優(yōu)勢表現(xiàn)在：僅需少量組織樣品，不需要液氮研磨，不需要離心，不需要氯仿、異丙醇等有機溶劑，無需更換離心管或深孔板，操作步驟少，節(jié)省大量時間。其缺點是DNA濃度太低，無法用電泳或紫外吸收法進(jìn)行檢測，保存時間不長，樣品量太少用研磨儀打碎困難等。

直擴PCR的擴增效果受多種因素影響。利用粗提DNA進(jìn)行直擴PCR時模板DNA少，對于低拷貝目標(biāo)序列可能會失敗[9]。Rogers等對不同物種葉盤法直擴PCR的研究認(rèn)為直擴PCR的效率在物種間存在差異，導(dǎo)致擴增失敗的原因不是模板量少，而是抑制物太多，使用更小的葉盤可以獲得較好的檢測效果[7]。Li等也認(rèn)為組織樣品的多少是直擴PCR成功的關(guān)鍵，太多的組織會抑制擴增，在反應(yīng)體系中加入硫酸銨可以增加引物退火的特異性，改善檢測效果[17]。用NaOH作為提取液的堿法獲得的粗提液，后續(xù)的稀釋起到關(guān)鍵作用[18]。在本研究中，陽性對照引物和TM4dcaps擴增效果較好，csSr2單株間擴增條帶強弱差異較大，cssfr1的擴增效果較差，說明引物的擴增效率對直擴PCR的效果也有影響。獲得足夠的DNA，降低抑制物的含量，是直擴PCR成敗的關(guān)鍵，不管是減少組織樣品量，還是稀釋粗提液，目前都存在個別樣品擴增效果不佳甚至失敗的問題。因此有必要進(jìn)一步研究改進(jìn)直擴PCR技術(shù)，為分子育種的高效率、低成本規(guī)?；瘧?yīng)用提供技術(shù)支持。

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