王玉 連娟 王聰 趙利利 趙寶存

摘要：高鹽是限制植物生長和發(fā)育的重要非生物脅迫因子。以耐鹽小麥RH8706-49根部基因表達(dá)譜芯片結(jié)果為基礎(chǔ)，利用電子克隆和RT-PCR方法克隆了一個鹽脅迫時上調(diào)表達(dá)的基因，命名為TaRSTR（登錄號：EU263918）。熒光定量PCR分析證實該基因受鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示TaRSTR蛋白定位在細(xì)胞核里。TaRSTR過表達(dá)提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥在鹽脅迫下的種子萌發(fā)率及成年植株的耐受性。TaRSTR基因過表達(dá)可顯著提高已知耐鹽相關(guān)基因AtFRY1、AtP5CS1和AtRD29B的表達(dá)量，推測TaRSTR基因通過這些標(biāo)記基因提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性。上述結(jié)果表明TaRSTR基因過表達(dá)能提高植株的耐鹽性，是植物耐鹽的正調(diào)節(jié)子。

關(guān)鍵詞：小麥;TaRSTR基因;耐鹽;實時定量PCR

中圖分類號：S512.103.4：Q781 ?文獻(xiàn)標(biāo)識號：A ?文章編號：1001-4942（2020）01-0010-07

Abstract High salinity is a very important abiotic stress factor that inhibits the growth and development of plant. The gene expression profile of salt-tolerant wheat mutant RH8706-49 under salt stress was investigated by microarray chip， and according to the results， a gene induced by salt stress was cloned and named TaRSTR （accession number： EU263918）. The real-time PCR analysis results confirmed that TaRSTR was indeed induced by salt stress. TaRSTR was located in nuclear. TaRSTR overexpression improved the seed germination rate and the salt tolerance of adult transgenic Arabidopsis plants under salt stress. TaRSTR overexpression increased the expression levels of abiotic stress related marker genes， such as AtFRY1， AtP5CS1 and AtRD29B. It was predicted that TaRSTR improved the salt tolerance of transgenic Arabidopsis thaliana via these marker genes. In summary， TaRSTR gene was invovled in salt-stress response and could positively regulate the salt tolerance in plant.

Keywords Triticum asetivum L.; TaRSTR gene; Salt tolerance; Quantitative real-time PCR

高鹽是嚴(yán)重影響農(nóng)作物產(chǎn)量的非生物脅迫因子之一。在漫長的進(jìn)化過程中，植物進(jìn)化出了對鹽的耐受機(jī)制。植物耐鹽是一個涉及多基因的遺傳性狀[1，2]。植物通過改變耐鹽相關(guān)基因的表達(dá)來調(diào)整細(xì)胞的生理活動過程，減輕鹽脅迫造成的傷害或提高植物對高鹽的耐受力[3.4]。在眾多的耐鹽相關(guān)基因中，RING/U-box家族基因在植物耐鹽方面起到重要作用。RING是Really Interesting New Gene的縮寫，RING結(jié)構(gòu)域（RING finger domain，RFD）是一種特殊類型的鋅指結(jié)構(gòu)，具有40至60個殘基，可結(jié)合兩個鋅原子。含RFD的蛋白不都具有規(guī)則的鋅指特征，其中，U-box就是RING結(jié)構(gòu)域的一種修飾形式，是由三個β-折疊和一個α-螺旋組成的RING結(jié)構(gòu)。RING/U-box家族蛋白種類繁多、功能多樣，在植物中分布最為廣泛[5]。RING/U-box蛋白參與蛋白質(zhì)之間的相互作用及泛素化[6，7]，并在各種細(xì)胞生命活動過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，包括植物對生物和非生物脅迫的耐受性[8，9] 。

對擬南芥中RING/U-box蛋白的研究顯示該家族在多種非生物脅迫過程中起作用，包括干旱、高鹽、冷和熱等[10，11]。油菜的RING/U-box蛋白也參與了冷、鹽和脫氫脅迫過程[8]。最近的研究表明，RING/U-box蛋白在植物應(yīng)對鹽脅迫的響應(yīng)中起著重要作用。番茄中的一個RING/U-box蛋白編碼基因SpRing是脅迫誘導(dǎo)型基因，參與了野生番茄（Solanum pimpinellifolium）的鹽脅迫信號傳導(dǎo)。SpRing在擬南芥中過表達(dá)增強(qiáng)了種子在發(fā)芽期間對鹽的耐受性，同時使某些關(guān)鍵脅迫相關(guān)基因的表達(dá)水平發(fā)生了變化[12]。水稻OsSIRP2基因編碼RING/U-box蛋白，其受鹽誘導(dǎo)表達(dá)，OsSIRP2過表達(dá)提高了水稻對鹽和滲透脅迫的耐受性，該蛋白介導(dǎo)植物在非生物脅迫和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的反應(yīng)[13]。水稻RING/U-box蛋白編碼基因OsRMT1在擬南芥中過表達(dá)提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥對鹽脅迫的耐受性，OsRMT1的降解受鹽脅迫抑制，推測OsRMT1參與了水稻的鹽耐受機(jī)制[14]。擬南芥中一個受ABA和其他脅迫處理誘導(dǎo)的AtAIRP4基因編碼RING/U-box蛋白。與野生型和atairp4突變株系相比，AtAIRP4過表達(dá)植物在種子萌發(fā)期間對鹽和滲透脅迫更加敏感，表明AtAIRP4是耐鹽的負(fù)調(diào)控因子[15]。

小麥（Triticum aestivum）作為一種重要的農(nóng)作物被廣泛種植，高鹽環(huán)境是其生長、發(fā)育、繁殖的一個重要限制因素，會造成小麥產(chǎn)量和品質(zhì)降低。因此，克隆小麥耐鹽相關(guān)基因，探索小麥在鹽脅迫下的應(yīng)激機(jī)制以及抗逆性適應(yīng)機(jī)理，對提高小麥耐鹽性有極其重要的意義。本研究根據(jù)小麥耐鹽突變體RH8706-49進(jìn)行NaCl脅迫處理后根部基因的表達(dá)譜芯片分析結(jié)果，得到一個鹽脅迫初期表達(dá)上調(diào)的EST探針，根據(jù)EST序列克隆了該基因，并對其表達(dá)模式、亞細(xì)胞定位和耐鹽功能進(jìn)行初步分析，為該基因的功能研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及植物培養(yǎng)方法

小麥耐鹽突變體RH8706-49（本研究室保存），耐鹽指數(shù)≥1.3[16]。將小麥種子在水中浸泡過夜，萌發(fā)后25℃光照（16 h光/8 h暗）培養(yǎng)，長至二葉一心時用175 mmol/L NaCl處理，于處理0、1、6、24、72 h時分別取葉片和根為材料，用于基因表達(dá)模式分析。野生型擬南芥（Arabidopsis thaliana）Col-0種子（本研究室保存）用75%乙醇和2.5%次氯酸鈉表面消毒，鋪于MS培養(yǎng)基上，4℃春化3～4 d后于22℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（16 h光/8 h暗），9 d后移到蛭石營養(yǎng)土中，于22℃溫室光照（16 h光/8 h暗）培養(yǎng)。

大腸桿菌（Escherichia coli）菌株DH5α、根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株GV3101、真核表達(dá)載體pRTL2-AN-mGFP和pCAMBIA1300-35S均為本實驗室保存。

1.2 TaRSTR基因克隆及生物信息學(xué)分析

根據(jù)小麥RH8706-49鹽脅迫下根部基因的表達(dá)譜芯片結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)探針（Ta.3452.3.S1_a_at）在鹽脅迫早期上調(diào)表達(dá)，上調(diào)至最高值之后下調(diào)[17]。以該探針的EST序列作為起始序列，利用電子拼接獲得全長cDNA的邏輯序列，以脅迫后RH8706-49的根部cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增片段進(jìn)行克隆測序。所用引物序列見表1。對克隆到的基因進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi），預(yù)測該基因的生物學(xué)功能。

1.3 RNA的提取和實時定量PCR

利用Trizol （天根生化科技有限公司，北京）試劑分別提取不同植物材料的總RNA，參照TaKaRa公司的Prime ScriptTMⅡ Reverse Transcriptase試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA后進(jìn)行實時定量PCR。實時定量PCR在Rotor-Gene 3000定量PCR儀（Gene Company Limited， USA）上進(jìn)行，分析軟件為RG3000 6.0版軟件（Gene Company Limited， USA）。小麥β-actin基因（登錄號：AB181991）為內(nèi)參，分析方法為ΔΔCt比較定量法，每一樣品3次生物學(xué)重復(fù)。定量引物序列見表1。

1.4 亞細(xì)胞定位載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化擬南芥

參照Yoo等[18]的方法將TaRSTR 的cDNA序列連接到載體pRTL2-AN-mGFP中，得到TaRSTR∷GFP融合表達(dá)載體，通過PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化擬南芥葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體，對轉(zhuǎn)化細(xì)胞進(jìn)行激光共聚焦顯微鏡觀察，根據(jù)熒光的位置確定蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位?？蛰d體pRTL2-AN-mGFP轉(zhuǎn)化的細(xì)胞作為對照。構(gòu)建載體的引物序列見表1。

1.5 過表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化擬南芥

將TaRSTR cDNA序列插入雙元表達(dá)載體pCAMBIA1300-35S中，獲得過表達(dá)重組載體。采用浸花法[19]將該重組載體轉(zhuǎn)化擬南芥Col-0。構(gòu)建載體的引物序列見表1。獲得轉(zhuǎn)基因植株后，分別進(jìn)行DNA水平（基因組DNA的PCR）和RNA水平（半定量RT-PCR）鑒定。確定轉(zhuǎn)基因是否成功。半定量RT-PCR以Atactin1（登錄號：AT2G37620）為內(nèi)參。引物序列見表1。

1.6 轉(zhuǎn)基因擬南芥耐鹽性分析

為了鑒定TaRSTR與耐鹽的關(guān)系，我們對不同發(fā)育時期的轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行耐鹽性鑒定。首先，將轉(zhuǎn)基因擬南芥株系的種子消毒后分別接種于MS0和含有120 mmol/L NaCl的MS培養(yǎng)基上，7 d后統(tǒng)計萌發(fā)率。其次，將正常培養(yǎng)5周的植株用175 mmol/L NaCl溶液澆灌，每4 d澆灌一次，處理8 d后觀察表型。每個處理均做3次生物學(xué)重復(fù)。

1.7 過表達(dá)TaRSTR基因?qū)ζ渌望}基因表達(dá)的影響

通過熒光定量PCR分析擬南芥中耐鹽相關(guān)基因AtRD29B、AtP5CS1、AtFRY1和AtSOS3在TaRSTR過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株和對照Col-0植株中的表達(dá)量，分析TaRSTR基因可能參與的鹽脅迫應(yīng)答信號途徑，以Atactin2（登錄號：AT3G18780）為內(nèi)參。定量PCR應(yīng)用的基因引物序列見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 TaRSTR基因的克隆及保守結(jié)構(gòu)域分析

利用RT-PCR技術(shù)，我們擴(kuò)增到一個853 bp的cDNA片段（圖1A），對該序列進(jìn)行克隆和測序，結(jié)果表明該序列包括756 bp的開放閱讀框，編碼包含251個氨基酸的蛋白質(zhì)，該蛋白中存在一個RING/U-box結(jié)構(gòu)域 （圖1B）。該基因命名為TaRSTR （RING salt-tolerant relative gene），序列已提交到GenBank，登錄號為EU263918。

2.2 TaRSTR基因在鹽脅迫下的表達(dá)量分析

為了檢測TaRSTR基因在鹽脅迫下的表達(dá)量，以二葉一心期的RH8706-49小麥幼苗為材料，在175 mmol/L NaCl脅迫0、1、6、24、72 h時分別取葉片和根，進(jìn)行實時定量PCR，分析TaRSTR基因在脅迫不同時間點的葉片和根中的表達(dá)量。結(jié)果表明，無論是在根中還是在葉中，TaRSTR基因在鹽處理1 h時表達(dá)量最高;之后隨處理時間延長，在葉中先下降后升高，脅迫72 h時TaRSTR基因的表達(dá)量是未脅迫（0 h）時的2倍;而在根中自1 h時達(dá)到最高值后，TaRSTR基因的表達(dá)量持續(xù)下調(diào)（圖2），表明TaRSTR基因在鹽脅迫初期即被誘導(dǎo)表達(dá)，但是在葉中和根中的表達(dá)模式不一樣。

2.3 TaRSTR的亞細(xì)胞定位

以GFP空載體為對照，將TaRSTR∷GFP融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)化擬南芥葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體，用激光共聚焦顯微鏡觀察TaRSTR蛋白的亞細(xì)胞定位。結(jié)果表明，對照GFP的熒光分布在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上（圖3A），而TaRSTR∷GFP融合蛋白的熒光只分布在細(xì)胞核里（圖3B），表明TaRSTR定位在細(xì)胞核內(nèi)。

2.4 TaRSTR過表達(dá)提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性

對獲得的3個轉(zhuǎn)基因純合體株系（OE-1，OE-2，OE-3）進(jìn)行基因組水平和mRNA水平的檢測，結(jié)果（圖4）發(fā)現(xiàn)，PCR和RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果中，對照Col-0中都沒有目的條帶出現(xiàn)，而3個轉(zhuǎn)基因純合體株系中都有TaRSTR基因的擴(kuò)增條帶，表明TaRSTR基因已經(jīng)整合進(jìn)擬南芥基因組（圖4D），并已經(jīng)表達(dá)（圖4E）。

以Col-0為對照，對TaRSTR過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系在NaCl處理下的萌發(fā)率進(jìn)行檢測。正常培養(yǎng)條件下，3個轉(zhuǎn)基因株系與對照的種子萌發(fā)率沒有明顯差異（圖4A、C），而120 mmol/L NaCl脅迫下，轉(zhuǎn)基因株系的萌發(fā)率均顯著高于對照Col-0（圖4B、C）。

以Col-0為對照，對正常培養(yǎng)35 d的野生型和TaRSTR過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行175 mmol/L NaCl澆灌處理，處理8 d后觀察表型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鹽處理前，對照植株和轉(zhuǎn)基因植株的長勢基本一致（圖5A），而鹽處理后對照Col-0的株高較矮、葉片枯萎，轉(zhuǎn)基因植株的生長狀態(tài)相對良好，植株更挺拔，果莢更多、更飽滿，結(jié)實率更高（圖5B）。上述結(jié)果表明，TaRSTR過表達(dá)能夠提高轉(zhuǎn)基因擬南芥在不同發(fā)育階段的耐鹽性。

2.5 TaRSTR過表達(dá)對擬南芥中耐逆相關(guān)標(biāo)記基因表達(dá)量的影響

為了從分子水平探索TaRSTR的耐鹽機(jī)理，對擬南芥中已報道的與植物非生物脅迫耐受性密切相關(guān)的4個基因（AtRD29B、AtP5CS1、AtFRY1和AtSOS3）進(jìn)行表達(dá)量分析。選取耐鹽性鑒定結(jié)果中耐鹽性較強(qiáng)的過表達(dá)株系OE-1（圖5B）為材料，以Col-0為對照，采用實時定量PCR鑒定不同標(biāo)記基因的表達(dá)量，結(jié)果表明，在TaRSTR基因過表達(dá)的情況下，AtFRY1、AtRD29B、AtP5CS1基因的表達(dá)量均顯著上調(diào)，而AtSOS3的表達(dá)量沒有明顯變化（圖6）?？梢?，TaRSTR過表達(dá)上調(diào)了部分耐逆相關(guān)標(biāo)記基因的表達(dá)。

3 討論與結(jié)論

本研究克隆的小麥基因TaRSTR編碼一個RING/U-box家族蛋白，該家族的蛋白參與泛素化過程，介導(dǎo)很多生物活動過程，包括對高鹽等非生物脅迫的適應(yīng)[20]。qRT-PCR試驗結(jié)果表明，TaRSTR基因在175 mmol/L NaCl處理1 h時表達(dá)量即上調(diào)至最高，說明TaRSTR是一個早期響應(yīng)鹽脅迫的基因。分子特征分析表明該蛋白定位于細(xì)胞核內(nèi)。已有報道表明，RING/U-box家族蛋白參與多種非生物脅迫的適應(yīng)過程[15]。在植物對鹽脅迫的響應(yīng)過程中幾種RING/U-box蛋白起著重要作用。例如擬南芥的AtAIRP4[15]、番茄的RING/U-box蛋白SpRing[12]、水稻的OsSIRP2[13]和OsRMT1[14]蛋白，均參與了植物的耐鹽過程。本研究中，TaRSTR過表達(dá)提高了擬南芥在萌發(fā)期和生殖生長時期的耐鹽性，表明TaRSTR是高鹽脅迫耐受的正調(diào)節(jié)子。

MAPK和SOS通路是高鹽、干旱和低溫脅迫下激活的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)[21]。我們對TaRSTR過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植物的這兩個重要耐逆脅迫信號通路中的標(biāo)記基因AtFRY1、AtRD29B、AtP5CS1（MAPK通路）和AtSOS3（SOS通路）的表達(dá)情況進(jìn)行分析，結(jié)果表明，TaRSTR過表達(dá)條件下，AtFRY1S、AtRD29B、AtP5CS1基因的表達(dá)量均顯著上調(diào)，而AtSOS3的表達(dá)量沒有明顯變化。其中AtFRY1編碼一種多磷酸肌醇-1-磷酸酶， 該酶可以提高三磷酸肌醇（inositol triphosphate，IP3）的濃度，提高信號傳導(dǎo)效率[22]。AtRD29B通過應(yīng)對滲透脅迫參與了鹽脅迫和旱脅迫，該基因表達(dá)上調(diào)提高了細(xì)胞對滲透脅迫的耐受[23， 24]。高等植物中，AtP5CS1是脯氨酸合成的限速酶[25]，增強(qiáng)該酶的表達(dá)能夠提高脯氨酸的含量[26]。AtP5CS1基因的過表達(dá)可以增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因煙草[27]和水稻[28]對非生物脅迫的耐受性。本研究結(jié)果表明，在TaRSTR過表達(dá)的條件下，上述標(biāo)記基因的表達(dá)量均有不同程度的上調(diào)，表明TaRSTR可以通過提高耐鹽標(biāo)記基因的表達(dá)來提高植物的耐鹽性，這與我們的表型鑒定結(jié)果是一致的。綜上所述，TaRSTR基因是一個受高鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的基因，TaRSTR定位在細(xì)胞核里，通過影響MAPK耐鹽通路的基因表達(dá)提高植物的耐鹽性。

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