徐 雨，馮明祥，韋登雄，圖 雅，劉 蘋，楊和俊，陳永翠

（貴州省關嶺縣動物疫病預防控制中心 561300）

血液原蟲病是牛最常見的寄生蟲病之一，大多數(shù)通過吸血節(jié)肢動物吸血傳播，導致牛貧血、消瘦、黃疸、血紅蛋白尿，嚴重危害養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展。 常見的牛血液原蟲有附紅細胞體（Eperythrozoon）、 雙芽巴貝斯 （B.bigemina）、 巴貝斯牛巴貝斯（Babesia bovis）、牛分歧巴貝斯（B.divergens）、卵形巴貝斯（B.ovata）、環(huán)形泰勒蟲(Theileria annulata)、瑟氏泰勒蟲(T.sergenti)等[1-3]。 本文對某養(yǎng)牛場個別牛消瘦進行寄生蟲病檢測，并對感染牛進行治療，降低養(yǎng)殖場損失。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 2019 年7 月， 關嶺縣某養(yǎng)牛場63 頭關嶺牛，其中有3 頭不明原因消瘦，抽取消瘦牛的糞便和血液樣品。

1.1.2 試劑 尼龍兜、玻片、吉姆薩染色試劑（Solarbio）、染色缸、生物顯微鏡（麥克迪奧實業(yè)集團有限公司）、無菌采血管、2×Taq Master Mix 試劑（康為世紀生物科技有限公司）、瓊脂糖（Amresco）、D5000DNA LAdder （Biomiga）、GoldView 核酸染料（Solarbio）、天根DP318-02 血液基因組DNA 提取試劑盒（北京諾博萊德科技有限公司）等。

1.2 方法

1.2.1 蟲卵檢測

按照尼龍兜集卵法[4]篩選蟲卵后，鏡檢。

1.2.2 染色鏡檢

血液推片，吉姆薩染色后，鏡檢[2]。

1.2.3 PCR 檢測

根據(jù)Genbank 上發(fā)表序列設計引物，其中雙芽巴貝斯和瑟氏泰勒斯蟲引物參照文獻[5]，見表1。

表1 引物序列

采用同一PCR 擴增體系：擴增10μL 反應體系，其中2×Taq Master Mix 5μL， 上、 下 游 引 物 各0.2μL，DNA 模 板0.2μL，ddH2O4.4μL。 擴增條件：預變性94℃5min，變性94℃30s，退火60℃30s， 延伸72℃60s，35 個循環(huán)， 再延伸72℃10 min，4℃保存；同時設立無引物的空白對照。 取PCR 產(chǎn)物電泳，觀察結(jié)果。

1.2.4 治療

用貝尼爾（血蟲凈）:按每千克體重5mg，用滅菌蒸餾水配成5%溶液，臀部深層注射；間隔48h 后再注射一次，2 周后血液推片鏡檢。 用0.5%敵百蟲噴灑牛體和圈舍，15d 后再次噴灑。

2 實驗結(jié)果

2.1 蟲卵檢測

未檢測出線蟲、絳蟲、球蟲、吸蟲蟲卵。

2.2 染色鏡檢

染色鏡檢后，箭頭指向可見紅細胞內(nèi)含紫色點狀，說明有血液原蟲感染。

圖1 染色鏡檢結(jié)果×1000 倍

2.3 PCR 檢測

PCR 電泳結(jié)果見圖2，擴增出的各條帶大小與預期一致，空白對照無條帶。 1 號樣品雙芽巴貝斯 （1800bp）、 牛分歧巴貝斯（250bp）、 瑟氏泰勒斯蟲 （800bp） 為陽性，2 號樣品附紅細胞體（800bp）、雙芽巴貝斯（1800bp）、牛分歧巴貝斯（250bp）、瑟氏泰勒斯蟲（800bp）為陽性，3 號樣品牛分歧巴貝斯（250bp）、（瑟氏泰勒斯蟲800bp）為陽性。

2.4 治療

圖2 PCR 電泳結(jié)果

圖3 染色鏡檢結(jié)果×1000 倍

兩周后，血液推片，染色鏡檢未見蟲體，見圖3。

3 討論

本次調(diào)查中， 該養(yǎng)殖場定期使用伊維菌素驅(qū)蟲， 并一直圈養(yǎng)，未發(fā)現(xiàn)線蟲、絳蟲、球蟲、吸蟲的蟲卵。 該場牛大部分無消瘦、黃疸、茶色尿等臨床癥狀，只有3 頭牛表現(xiàn)出消瘦癥狀，抽取血液鏡檢發(fā)現(xiàn)有血液原蟲感染，后PCR 鑒定為附紅細胞體、雙芽巴貝斯、牛分歧巴貝斯和瑟氏泰勒斯蟲。 血液鏡檢未發(fā)現(xiàn)附紅細胞體和雙芽巴貝斯蟲感染，推測該場牛飼養(yǎng)良好，群體健壯，抵抗力強，感染程度不高，發(fā)病不多，但血液原蟲病長期攝取寄主能量，影響宿主生長，一旦遇到天氣變化、飼養(yǎng)不善等情況，抵抗力變?nèi)?，極有可能大批量發(fā)病，用藥治療后，復查未見蟲體，證明貝尼爾對血液原蟲治療效果明顯。 因此，建議該場因?qū)⒇惸釥査幬镒鳛槎ㄆ隍?qū)蟲藥物。