千佳 黨詩(shī)沛 周興 但旦 汪召軍 趙天宇梁言生 姚保利? 雷銘2)?

1) (中國(guó)科學(xué)院西安光學(xué)精密機(jī)械研究所， 瞬態(tài)光學(xué)與光子技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 西安 710119)

2) (中國(guó)科學(xué)院大學(xué)光電學(xué)院， 北京 100049)

3) (西安交通大學(xué)理學(xué)院， 西安 710049)

(2020 年3 月9日收到; 2020 年4 月2日收到修改稿)

結(jié)構(gòu)光照明顯微是一種寬場(chǎng)顯微技術(shù)， 可以實(shí)現(xiàn)超分辨成像和三維光切片成像. 基于HSV (色相、飽和度、明度)彩色空間的結(jié)構(gòu)光照明全彩色三維光切片成像技術(shù)可以復(fù)原樣品表面的真彩色信息， 但每一層光切片都需要采集3幅固定相移差的原始圖像， 這對(duì)于需要多視場(chǎng)拼接的大尺寸樣品而言， 圖像采集數(shù)據(jù)量大、圖像重構(gòu)時(shí)間長(zhǎng)的缺點(diǎn)就凸顯出來. 鑒于此， 本文提出一種基于希爾伯特變換的結(jié)構(gòu)光照明快速三維彩色顯微成像方法， 只需在樣品的每一層采集2幅原始圖像便可以重構(gòu)出該層的全彩色光切片圖像， 因此圖像采集量減少了1/3， 圖像重構(gòu)時(shí)間節(jié)約了約28%， 有效提高了彩色三維成像的效率和速度.

1 引 言

生物結(jié)構(gòu)在不同尺度、不同維度和不同部位的觀察與形態(tài)分析， 為科學(xué)研究提供最直接的證據(jù)，在眾多學(xué)科領(lǐng)域扮演了不可或缺的角色. 目前生物結(jié)構(gòu)的二維形態(tài)觀察手段已非常成熟， 但三維技術(shù)手段卻相對(duì)滯后. 三維光學(xué)成像技術(shù)具有非接觸、快速、精確等優(yōu)點(diǎn)， 是獲取樣品表面形態(tài)特征的一種重要手段， 也是真實(shí)物體三維數(shù)字化的基礎(chǔ)， 在生物醫(yī)學(xué)、精密測(cè)量等領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用.

色彩信息是描述生物體特征的一個(gè)重要物理量， 生物體表面色彩的不同色相、飽和度和明度在很大程度上反映了其微觀結(jié)構(gòu)和光學(xué)性質(zhì)的不同.例如昆蟲體表的結(jié)構(gòu)色大都是由其表面的微納結(jié)構(gòu)產(chǎn)生， 結(jié)構(gòu)色已成為昆蟲分類和物種鑒定的一個(gè)重要指征[1-3]. 以激光掃描共聚焦顯微鏡為代表的點(diǎn)掃描顯微成像技術(shù)具有三維層析成像能力[4-6]，結(jié)合多通道融合技術(shù)可以獲得三維熒光樣品的偽彩圖像[7，8]， 但是受制于濾光片的有限帶寬， 激光共聚焦掃描顯微鏡無法復(fù)原樣品的真實(shí)全彩色信息.

而作為一種寬場(chǎng)顯微技術(shù)， 結(jié)構(gòu)光照明顯微(structured illumination microscopy， SIM)可以實(shí)現(xiàn)超分辨成像[9-11]以及三維光切片成像[12-15]， 在生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域已經(jīng)獲得了廣泛的應(yīng)用. 光切片SIM成像首先由牛津大學(xué)的Neil等[12]提出， 使用面陣相機(jī)采集3幅固定相移差的原始圖像并通過均方根(root mean square， RMS)運(yùn)算重構(gòu)出樣品去除離焦背景的光切片圖像. 其基本原理是顯微物鏡有一定的景深， 因此CCD相機(jī)得到的圖像實(shí)際上是焦面信息和離焦背景的疊加. 在顯微成像時(shí)，高頻信息會(huì)隨著離焦距離的增加而快速衰減， 只有焦面的信息才會(huì)保持不變. SIM使用具有不同相位的高空間頻率正弦條紋對(duì)樣品進(jìn)行照明， 因此只有焦平面附近才會(huì)出現(xiàn)條紋， 而離焦區(qū)域的條紋會(huì)迅速衰減變?yōu)榫鶆虻膶拡?chǎng)照明， 這相當(dāng)于對(duì)焦面的目標(biāo)進(jìn)行了編碼， 而離焦背景保持不變， 這也是使用不同相位的結(jié)構(gòu)光照明樣品時(shí)， 離焦背景保持不變的原因[16-19]. 2015年， 我們使用彩色數(shù)字相機(jī)記錄白光或多色結(jié)構(gòu)光照明獲得的彩色圖像， 使用基于色相(hue)、飽和度(saturation)、明度(value)空間的HSV彩色光切片算法(HSV color space-root mean square algorithm， HSV-RMS)， 實(shí)現(xiàn)了高分辨全彩色快速三維成像[20]. 通過多視場(chǎng)拼接技術(shù)，2019年我們進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)了厘米量級(jí)昆蟲樣品的高分辨率全彩色三維成像[21].

HSV-RMS方法需要采集3幅固定相移差的圖像并通過RMS算法計(jì)算重構(gòu)出一幅消除離焦背景的光切片圖像， 因此需要采集3倍于普通寬場(chǎng)成像的圖像數(shù)據(jù)， 而且其彩色圖像重構(gòu)過程需要在H， S， V 3個(gè)通道中分別進(jìn)行3次RMS運(yùn)算以及2次RGB和HSV空間的圖像轉(zhuǎn)換， 計(jì)算耗時(shí)較大. 2015年， 我們課題組提出了一種基于希爾伯特變換的快速SIM三維成像方法， 只需采集2幅任意相移差的原始圖像便可以重構(gòu)出一幅光切片圖像[19]， 但是該技術(shù)當(dāng)時(shí)局限于單色三維成像， 無法恢復(fù)樣品的彩色信息. 鑒于此， 本文將希爾伯特變換的快速光切片算法與彩色結(jié)構(gòu)光照明光切片技術(shù)結(jié)合， 提出一種新的基于希爾伯特變換的結(jié)構(gòu)光照明快速三維彩色顯微成像方法(Hilberttransform-based color optical sectioning method，HT-COS)， 相比于 HSV-RMS 方法， HT-COS 的圖像采集量減少了1/3， 圖像重構(gòu)時(shí)間節(jié)約了約28%.該方法有望進(jìn)一步擴(kuò)展SIM技術(shù)的適用領(lǐng)域， 在生物學(xué)、材料科學(xué)研究中獲得重要應(yīng)用.

2 SIM光切片算法

2.1 RMS光切片算法

RMS層析解碼算法需要通過改變結(jié)構(gòu)光場(chǎng)的相位獲取3幅子圖像， 相鄰子圖像之間的加載條紋相位差通常需嚴(yán)格匹配至2π/3， 繼而通過特定的公式提取出焦面信息， 這是目前應(yīng)用最為廣泛的方法， 由 Neil等[12]首先提出.

假設(shè)所使用的結(jié)構(gòu)照明正弦條紋光場(chǎng)強(qiáng)度分布滿足:

其中，m為正弦條紋的調(diào)制度，p為條紋的空間頻率，φ0為條紋的初相位. 使用3幅相移差為2π/3的結(jié)構(gòu)照明光場(chǎng)對(duì)樣品進(jìn)行照明， 可得采集到的3幅圖像的表達(dá)式為

其中，Iin表示樣品的焦面圖像信息，Iout表示離焦部分的圖像信息， 只有焦面圖像Iin受到了正弦條紋光場(chǎng)的調(diào)制， 對(duì)采集到的3幅圖像兩兩相減可得去除離焦背景的3幅結(jié)構(gòu)照明圖像:

此時(shí)， 樣品的焦面信息Iin仍然受到正弦條紋光場(chǎng)的調(diào)制， Neil等[12]提出的RMS算法正是對(duì)(3)式得到的3幅圖像進(jìn)行均方根計(jì)算， 即:

除了2π/3相移， 相移量為π/2的正弦條紋結(jié)構(gòu)光也可實(shí)現(xiàn)光切片圖像重建， 相比2π/3相移量， 在利用數(shù)字微鏡器件(digital micro-mirror device，DMD)投影產(chǎn)生結(jié)構(gòu)光照明的SIM系統(tǒng)中， 相移量為π/2的條紋通常可以實(shí)現(xiàn)更高的條紋頻率， 進(jìn)而獲得更優(yōu)的光切片效果[15]. 此時(shí)， (2)式可寫作:

由(6)式可以看出，I0和Iπ之和恰好可以消除含有條紋的調(diào)制項(xiàng)， 而兩者的差可以消除離焦背景， 類似于 (3)式， 可以構(gòu)造得到

2.2 基于希爾伯特變換的光切片算法

希爾伯特變換是信號(hào)分析處理領(lǐng)域的一種常用方法， 以一維信號(hào)為例， 希爾伯特變換實(shí)質(zhì)上是信號(hào)與 1/(πt)的卷積運(yùn)算， 即:

顯然， 正弦信號(hào)和其希爾伯特變換結(jié)果的平方和為1， 恰好可以消除正弦條紋. 兩幅相移差為的正弦結(jié)構(gòu)光照明圖像可表示為

將兩幅圖像相減， 首先消除了離焦背景的影響， 并令y=， 則該位置的一維信號(hào)可以表示為

對(duì)(7)式進(jìn)行希爾伯特變換， 然后取其頻譜， 可得

其中C=，=， 由 (15) 式可得

對(duì)比(14)式與(16)式可知， 經(jīng)過希爾伯特變換之后， 正弦結(jié)構(gòu)光照明圖像產(chǎn)生了π/2的相移， 二者的平方和可以去除焦平面上的正弦結(jié)構(gòu)圖樣. 以上分析為y=處的一維信號(hào)分析， 在y方向上所有位置全部進(jìn)行上述運(yùn)算， 則可實(shí)現(xiàn)整幅二維圖像的圖像重構(gòu)處理， 進(jìn)而獲得焦平面上去除正弦結(jié)構(gòu)條紋的光切片圖像， 即:

基于希爾伯特變換的快速層析算法僅需兩幅任意相移差的子圖像即可完成圖像的解碼重構(gòu)， 實(shí)驗(yàn)中以某一個(gè)成像平面為例， 其具體過程簡(jiǎn)述為:先將在該平面獲取的不同初相位結(jié)構(gòu)光照明的子圖像進(jìn)行相減， 獲得僅含焦面編碼信息的新圖像;再將新圖像沿著與編碼條紋空間頻率方向進(jìn)行希爾伯特變換并與子圖像差值取平方和， 即可獲得有效解碼后的層析圖像. 以橫條紋(即y方向強(qiáng)度為正弦分布)為例， (17)式可寫作:

相對(duì)于傳統(tǒng)的RMS解碼算法， 基于希爾伯特變換的快速層析解碼算法具有明顯的優(yōu)勢(shì)[19]: 首先， 快速層析解碼算法需要兩幅原始圖像即可完成層析圖像重構(gòu)， 將圖像采集量減小了33%. 其次，快速層析解碼算法對(duì)相移誤差不敏感， 微小的相移誤差并不影響三維重構(gòu)效果， 避免了傳統(tǒng)RMS解碼算法在子圖像加載條紋相位差不匹配時(shí)帶來的殘余條紋問題.

2.3 基于希爾伯特變換的彩色光切片算法

基于HSV-RMS方法， 將采集到的3幅固定相移差的原始彩色圖像轉(zhuǎn)換至HSV空間， 并在相應(yīng)的通道利用RMS算法進(jìn)行光切片處理， 隨后將處理完成的結(jié)果轉(zhuǎn)換至RGB空間進(jìn)行存儲(chǔ)并顯示.這一方法能夠復(fù)原樣品表面的全彩色信息， 已經(jīng)成功應(yīng)用于昆蟲結(jié)構(gòu)色的研究中[20，21]. 然而該方法需采集3幅固定相移差的原始圖像， 并且在HSV空間的三通道要進(jìn)行3次RMS運(yùn)算， 另外還需要在HSV空間和RGB空間進(jìn)行兩次轉(zhuǎn)換， 對(duì)于需要視場(chǎng)拼接的大尺寸樣品而言， HSV-RMS方法的圖像采集數(shù)據(jù)量大， 圖像處理算法更耗時(shí). 為此本文提出HT-COS方法.

圖 1 HT-COS算法流程圖和HSV-RMS算法流程圖對(duì)比 (a) HT-COS算法流程圖; (b) HSV-RMS算法流程圖Fig. 1. Flowchart diagram comparison between HT-COS algorithm and HSV-RMS algorithm: (a) HT-COS algorithm; (b) HSVRMS algorithm.

使用彩色相機(jī)采集得到2幅相移差為π的原始彩色圖像， 首先利用(19)式得到消除條紋的均勻照明的寬場(chǎng)圖像; 將原始圖像轉(zhuǎn)換為灰度圖像， 并利用(18)式計(jì)算得到光切片灰度圖像， 而寬場(chǎng)圖像則攜帶有樣品的全部色彩信息， 二者相乘的結(jié)果為: 寬場(chǎng)圖像的色彩將賦予光切片圖像， 進(jìn)而快速地獲得樣品的彩色光切片圖像， 算法流程圖如圖1(a)所示. 沿樣品軸向進(jìn)行掃描， 并對(duì)每一層的重構(gòu)結(jié)果進(jìn)行疊加， 將得到樣品的三維彩色光切片圖像.

2.4 相移誤差對(duì)HSV-RMS算法以及HTCOS算法的影響對(duì)比

RMS算法對(duì)原始圖像的相移差有著嚴(yán)格要求， 相移的微小誤差便會(huì)影響到三維重構(gòu)的效果，導(dǎo)致光切片圖像中出現(xiàn)明顯的殘余條紋， 而殘余條紋的出現(xiàn)會(huì)在很大程度上影響對(duì)樣品真實(shí)結(jié)構(gòu)的觀察與判斷， 以π/2相移的3幅原始正弦條紋圖像為例， 假設(shè)圖像在采集過程中由于環(huán)境振動(dòng)引入了相移誤差Δφ， 那么這3幅原始圖像可以寫作:將(20)式代入(8)式， 可以求得經(jīng)RMS算法重構(gòu)的圖像為

由此可知， 當(dāng)原始圖像的相移差存在Δφ的誤差時(shí)，RMS算法計(jì)算得到的光切片圖像中將存在殘余條紋. 由圖1(b)可知， HSV-RMS算法在得到光切片圖像后， 還需利用(19)式計(jì)算得到的去除條紋的寬場(chǎng)圖， 此時(shí)寬場(chǎng)圖中也將出現(xiàn)少量的殘余條紋:

在HSV-RMS算法后續(xù)圖像處理過程中， (21)式和(22)式相乘， 會(huì)使二者的殘余條紋被進(jìn)一步放大， 進(jìn)而導(dǎo)致最終的彩色光切片圖像中出現(xiàn)嚴(yán)重的殘余條紋:

在基于希爾伯特變換的光切片算法中， 當(dāng)兩幅相移差為π的結(jié)構(gòu)光照明圖像中存在相移誤差Δφ時(shí)， (14)式可以寫作:

對(duì)其進(jìn)行希爾伯特變換可得

其中CΔ=2msin[(Δφ+π)/2]，=，將(24)式和(25)式代入(17)式可知， 光切片計(jì)算結(jié)果中并不會(huì)出現(xiàn)誤差Δφ的調(diào)制項(xiàng)， 也就不存在殘余條紋.

HT-COS算法中只有(22)式計(jì)算引入的微小的殘余條紋， 在最終計(jì)算得到的彩色光切片圖像中可以被近似忽略:

因此， HT-COS算法對(duì)微小的相移誤差并不敏感， 不影響其三維光切片重建的效果.

為驗(yàn)證上述結(jié)論， 模擬了不同相移誤差對(duì)三維光切片重建效果的影響， 以π/2相移的HSV-RMS算法和HT-COS算法為例， 分別假設(shè)相移誤差為0.01π， 0.02π 和 0.05π， 數(shù)值模擬計(jì)算了 HSV-RMS算法和HT-COS算法的圖像重構(gòu)效果， 如圖2所示， 其中綠色虛線方框內(nèi)為綠色實(shí)線方框區(qū)域內(nèi)的放大圖像. 由圖2(c)—(f)可以看出， 在相移誤差為0.01π時(shí)， HSV-RMS算法光切片圖像中無明顯殘余條紋， 當(dāng)相移誤差為 0.02π 時(shí)， HSV-RMS算法復(fù)原的光切片圖像出現(xiàn)了明顯的殘余條紋， 而當(dāng)相移誤差增大為0.05π時(shí)， 殘余條紋非常嚴(yán)重. 如圖2(g)—(j)所示， HT-COS算法復(fù)原算法對(duì)相移誤差并不敏感， 在相移誤差為0.01π和0.02π時(shí)，復(fù)原的光切片圖像中并沒有出現(xiàn)殘余條紋， 當(dāng)相移誤差增加至0.05π時(shí)， 圖像中出現(xiàn)了極少量的殘余條紋. 因此本文提出的HT-COS算法具有更高的魯棒性， 特別適用于存在機(jī)械振動(dòng)等噪聲干擾的實(shí)驗(yàn)環(huán)境.

2.5 噪聲對(duì)HSV-RMS算法和HT-COS算法的影響對(duì)比

假設(shè)實(shí)驗(yàn)中采集的結(jié)構(gòu)光照明圖像中， 存在有隨機(jī)分布的高斯噪聲N(x，y)， 3幅π/2相移的原始圖像可以寫作:

當(dāng)利用RMS算法進(jìn)行光切片處理時(shí)， 根據(jù)(7)式，對(duì)(27)式的三項(xiàng)進(jìn)行循環(huán)相減操作， 可得

其中，NC表示均值噪聲[22]， 并有

求取(28)式兩項(xiàng)的平方和， 有

利用(8)式計(jì)算可得在噪聲環(huán)境下的光切片為

由此可知， RMS算法計(jì)算得到光切片圖像的信噪比與結(jié)構(gòu)照明光場(chǎng)的調(diào)制度有關(guān)， 調(diào)制度越高， 信噪比越高.

當(dāng)利用希爾伯特變換的方法進(jìn)行光切片處理時(shí)， 相移差為π的兩幅圖像相減可得

對(duì)(32)式進(jìn)行希爾伯特變換可得

將(32)式和(33)式代入(17)式， 可得噪聲環(huán)境下的光切片圖像為

對(duì)比(31)式和(34)式， 希爾伯特變換方法在噪聲環(huán)境下求得的光切片圖像同樣與結(jié)構(gòu)照明條紋的對(duì)比度有關(guān)， 調(diào)制度越高信噪比越高. 在同樣的噪聲參數(shù)下， RMS算法得到的光切片圖像中的噪聲項(xiàng)大于希爾伯特變換的方法， 因此， 希爾伯特變換算法相比于RMS算法， 具有更強(qiáng)的抗噪能力.

在圖3中， 模擬了均值為0， 方差分別為0.01，0.02和0.03時(shí)的高斯噪聲對(duì)HSV-RMS算法以及HT-COS算法在彩色光切片處理時(shí)的影響， 所用正弦結(jié)構(gòu)照明條紋的調(diào)制度m=0.8. 高斯噪聲方差為0.01時(shí)， 結(jié)構(gòu)光照明圖像， HSV-RMS算法得到的光切片圖像， HT-COS算法得到的光切片圖像的峰值信噪比(peak signal-to-noise ratio， PSNR)分別為25.74， 22.93以及23.69; 當(dāng)方差為0.03時(shí)，PSNR分別為23.62， 18.81以及21.91; 當(dāng)方差為0.05時(shí)， PSNR分別為22.21， 17.35和20.51.

圖 2 相移誤差對(duì)三維光切片圖像的影響- (a)含有離焦背景的寬場(chǎng)圖像; (b)結(jié)構(gòu)光照明圖像; (c)(f)在不同的相移-誤差下， HSV-RMS算法所復(fù)原的彩色光切片圖像;(g)(j) 不同相移誤差下， HT-COS算法所復(fù)原的彩色光切片圖像Fig. 2. Effect of phase-shift error on optical sectioning images:(a) Wide-field image with defocused background; (b) structured illumination image; (c)-(f) three-dimensional (3D)color optical sectioning images processed by HSV-RMS algorithm under different phase-shift errors; (g)-(j) 3D color optical sectioning images processed by HT-COS algorithm under different phase-shift errors.

2.6 HSV-RMS算法和HT-COS算法色彩復(fù)原保真度對(duì)比

在無噪聲和無相移誤差的條件下， 理論模擬了HSV-RMS算法和HT-COS算法計(jì)算所得彩色光切片圖像的色彩復(fù)原保真度， 如圖4所示. 圖4(a)為原始的寬場(chǎng)圖像， 為了更加直觀地說明問題，專門設(shè)計(jì)了一個(gè)含有4個(gè)色塊的圖像， 其中4個(gè)色塊的 RGB 值分別為 (77， 187， 95)， (230， 34， 207)，(198， 209， 55)和 (106， 56， 56). 圖 4(b)和圖 4(c)分別為HSV-RMS算法和HT-COS算法計(jì)算得到的彩色光切片圖像， 圖4(d)—(f)分別為3幅圖像中各色塊的RGB值. 與原始圖像比， HSV-RMS算法和HT-COS算法計(jì)算得到的彩色光切片圖像的色彩保真度均達(dá)到99.4%以上， 證明HT-COS算法和HSV-RMS算法都可以準(zhǔn)確復(fù)原樣品的三維全彩色光切片圖像.

圖 3 高斯噪聲對(duì)光切片重構(gòu)圖像的影響 (a)-(c) 高斯噪聲方差為0.01時(shí)的結(jié)構(gòu)光照明圖像、HSV-RMS算法得到的光切片圖像及HT-COS算法得到的光切片圖像; (d)-(f) 高斯噪聲方差為0.03時(shí)的結(jié)果; (g)-(i) 高斯噪聲方差為0.05時(shí)的結(jié)果Fig. 3. Influence of Gaussian noise on the reconstructed optical sectioning images. Structured illumination image， optical sectioning images calculated by the HSV-RMS algorithm and HT-COS algorithm， respectively， under the conditions of the Gaussian noise with variances of (a)-(c) 0.01， (d)-(f) 0.03， and (g)-(i) 0.05.

圖 4 HSV-RMS算法和HT-COS算法的色彩復(fù)原保真度比較 (a)-(c)分別為原始圖像、HSV-RMS算法處理后的光切片圖像及HT-COS算法處理后的光切片圖像; (d)-(f) 3幅圖像各色塊內(nèi)的RGB值Fig. 4. Comparison of color restoration fidelity between HSV-RMS algorithm and HT-COS algorithm: (a)-(c) Raw image， optical sectioning image calculated by HSV-RMS algorithm and optical sectioning image calculated by HT-COS algorithm， respectively;(d)-(f) RGB values for the four different regions of each image.

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)

本文所有實(shí)驗(yàn)是均在自行設(shè)計(jì)的基于DMD和發(fā)光二極管 (light emission diode， LED)照明的SIM系統(tǒng)上進(jìn)行的， 如圖5所示. 高亮度白光LED或者特定波長(zhǎng)LED發(fā)射的光束經(jīng)過特殊設(shè)計(jì)的全內(nèi)反射 (total internal reflection， TIR)棱鏡后照射DMD芯片， 經(jīng)過DMD調(diào)制后的正弦條紋結(jié)構(gòu)光場(chǎng)再經(jīng)過TIR棱鏡之后經(jīng)由投影系統(tǒng)和物鏡透射至樣品表面， 樣品的反射光或激發(fā)熒光經(jīng)過二向色濾光片或50/50濾光片后被彩色相機(jī)收集. 樣品被固定在三維電動(dòng)位移臺(tái)上， 用來實(shí)現(xiàn)軸向掃描和X-Y方向的視場(chǎng)拼接. 硬件同步控制、圖像采集和處理軟件均基于C++自行設(shè)計(jì)開發(fā).

圖 5 結(jié)構(gòu)光照明彩色光切片實(shí)驗(yàn)光路及系統(tǒng)圖 (a) 系統(tǒng)光路原理圖; (b)系統(tǒng)實(shí)物圖Fig. 5. Schematic diagram of structured illumination color optical sectioning system: (a) Light-path diagram; (b) apparatus diagram.

圖 6 HSV-RMS算法和HT-COS算法重構(gòu)的花粉彩色三維光切片圖像效果對(duì)比 (a) HSV-RMS算法重構(gòu)的三維圖像; (b) HTCOS算法重構(gòu)的三維圖像; (c) 圖(a)紫色方框區(qū)域的放大圖像; (d) 圖(b)綠色方框區(qū)域內(nèi)的放大圖像; (e) 圖(c)中藍(lán)色虛線和圖(d)中紅色實(shí)線上的強(qiáng)度分布; 標(biāo)尺: 30 μmFig. 6. Comparison of reconstructed result of pollen grain between HSV-RMS algorithm and HT-COS algorithm: (a) 3D reconstructed color image from HSV-RMS algorithm; (b) 3D reconstructed color image from HT-COS algorithm; (c) the enlarged image in the purple rectangular box in panel (a); (d) the enlarged image in the green rectangular box in (b); (e) normalized intensity distribution of the line-scan in panel (c) and (d)， i.e. the “root-shaped” structure. Scale bar: 30 μm.

3.2 熒光樣品實(shí)驗(yàn)

我們選取具有寬光譜自發(fā)熒光(405 nm激發(fā)波長(zhǎng))的花粉樣品進(jìn)行彩色三維成像實(shí)驗(yàn)， 使用波長(zhǎng)為405 nm的紫光LED光源和長(zhǎng)通二向色鏡(LP425 nm). 在樣品的每層以20 ms曝光時(shí)間分別采集相移差為π/2的3幅原始結(jié)構(gòu)光照明圖像， 利用HSV-RMS算法進(jìn)行處理. 隨后從采集的原始圖像中選取相移差為π的兩幅圖像， 再利用HT-COS算法進(jìn)行處理. 實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如圖6所示. 圖6(a)為HSV-RMS算法處理后的三維彩色光切片圖像， 圖6(b)為HT-COS算法處理后的結(jié)果， 顯然兩種算法都可以得到樣品的彩色三維熒光圖像.

但由于HSV-RMS算法對(duì)3幅原始圖像的相移差有嚴(yán)格的要求， 實(shí)驗(yàn)中的微小振動(dòng)就會(huì)造成相移差的變化， 進(jìn)而導(dǎo)致重構(gòu)的光切片圖像中產(chǎn)生殘余條紋， 對(duì)三維重建產(chǎn)生影響， 為了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證這一結(jié)論， 在實(shí)驗(yàn)中加入了微小的相移擾動(dòng). 圖6(c)和圖6(d)對(duì)比了HSV-RMS算法和HT-COS算法重構(gòu)結(jié)果中的殘余條紋. 圖6(c)為圖6(a)中紫色方框內(nèi)的放大圖像， 可以看出， 圖6(c)中存在比較明顯的殘余條紋; 圖6(d)為圖6(b)中綠色方框內(nèi)的放大圖像， 其中幾乎沒有殘余條紋. 圖6(e)中曲線的強(qiáng)度分布也驗(yàn)證了HSV-RMS算法存在明顯的殘余條紋， 花粉尖刺根部的“根狀”結(jié)構(gòu)被淹沒在殘余條紋之中， 而經(jīng)由HT-COS重構(gòu)的光切片圖像則沒有殘余條紋， “根狀”結(jié)構(gòu)清晰可見， 這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了HT-COS算法魯棒性更高的結(jié)論.

圖 7 一種中華虎甲背部的三維彩色SIM成像結(jié)果 (a) 該中華虎甲樣品完整三維圖像的二維最大值投影， 使用4 ×， NA =0.2物鏡拍攝， 共拼接84個(gè)視場(chǎng)， 單視場(chǎng)軸向掃描350層; (b) 樣品軸向進(jìn)行三維疊加重構(gòu)的示意圖， 每一層都是經(jīng)過HSVRMS算法處理后的光切片圖; (c) 圖(a)中紅色箭頭所指區(qū)域局部放大的三維光切片最大值投影圖像， 使用HSV-RMS算法進(jìn)行圖像處理， 20 ×， NA = 0.45物鏡拍攝; (d) 圖(c)的三維形貌分布; (e) 樣品軸向進(jìn)行三維疊加重構(gòu)的示意圖， 每一層都是經(jīng)過HT-COS算法處理后的光切片圖; (f)圖(a)中紅色箭頭所指區(qū)域局部放大的三維光切片最大值投影圖像， 使用HT-COS算法進(jìn)行圖像處理， 20 ×， NA = 0.45物鏡拍攝; (g) 圖(f)的三維形貌分布Fig. 7. 3D color imaging result of a Chinese tiger beetle: (a) Maximum intensity projection image of the tiger beetle under 4 ×， NA= 0.2 objective lens， the 3D volume is rendered from 84 data sets stitching and sliced 350 layers; (b) schematic diagram of 3D reconstruction in axial direction after imaging processing with HSV-RMS algorithm; (c) maximum intensity projection images of the area pointed by the red arrow in panel (a) processed with HSV-RMS algorithm. The images are captured under 20 ×， NA =0.45 objective lens; (d) 3D height map of panel (c); (e) schematic diagram of 3D reconstruction in axial direction after imaging processing with HT-COS algorithm; (f) maximum intensity projection images of the area pointed by the red arrow in (a) processed with HT-COS algorithm. The images are captured under 20 ×， NA = 0.45 objective lens; (g) the 3D height map of panel (f).

3.3 反射式樣品實(shí)驗(yàn)

為了進(jìn)一步證明HT-COS算法在圖像采集和重構(gòu)的速度優(yōu)勢(shì)， 對(duì)一種中華虎甲背部某區(qū)域進(jìn)行了高分辨率三維成像. 首先將光路中的二向色鏡替換為50∶50分束鏡， 將405 nm波長(zhǎng)LED替換為高亮度白光LED， 并分別采用HSV-RMS算法和HT-COS算法對(duì)原始圖像進(jìn)行處理， 結(jié)果如圖7所示. 該中華虎甲的三維尺寸大約為19.5 mm ×8.3 mm × 6.6 mm， 對(duì)其整體進(jìn)行了三維成像(使用 4 ×，NA= 0.2 物鏡拍攝， 空間分辨率 1.5 μm)，共采集84個(gè)視場(chǎng)進(jìn)行拼接， 如圖7(a)所示. 根據(jù)統(tǒng)計(jì)， 使用4 ×，NA= 0.2物鏡對(duì)樣品進(jìn)行三維成像時(shí)， 共拼接 84 個(gè)視場(chǎng) (14 行 × 6 列， 單視場(chǎng)尺寸 2.5 mm × 2.5 mm)， HSV-RMS 算法所需原始圖像的總圖像采集時(shí)間約為1767 s， 即84視場(chǎng) ×((10 ms曝光時(shí)間 + 0.031 ms DMD刷新時(shí)間) ×3幅相移圖像(相移差π/2) × 350層 + 30 ms位移臺(tái)穩(wěn)定時(shí)間 × 349次軸向移動(dòng)) + 83次橫向移動(dòng) ×30 ms位移臺(tái)穩(wěn)定時(shí)間， 而HT-COS算法只需要兩步相移(相移差π)， 因此圖像采集時(shí)間為1472 s，提升約16.7%. 兩種方法的圖像處理時(shí)間分別為13608和9744 s， 可知HT-COS算法是具有更快的圖像處理速度， 提升約28.4% (Windows 7 SP1，16GB RAM， Intel core i5-3470@3.2 GHz， Matlab R2017a). 表1對(duì)比了兩種方法的圖像采集時(shí)間和圖像處理時(shí)間， HT-COS算法84個(gè)視場(chǎng)的圖像采集時(shí)間和圖像處理時(shí)間分別減少了295和3864 s，這一提升對(duì)于需要視場(chǎng)拼接的高分辨率三維成像而言是十分可觀的. 因此HT-COS算法更加適用于大尺寸樣品的高分辨率三維成像， 可以大幅減小實(shí)驗(yàn)所需時(shí)間.

在樣品某區(qū)域(圖7(a)中紅色箭頭指向區(qū)域)利用20×，NA= 0.45物鏡進(jìn)行局部放大并進(jìn)行了兩種方法的比較實(shí)驗(yàn). 對(duì)比圖7(c)和圖7(f)可以看出， 在沒有相移誤差的條件下， HT-COS算法在圖像對(duì)比度、色彩還原度以及圖像分辨率方面與HSV-RMS算法相比并無明顯差異.

由于SIM三維光切片成像結(jié)果消除了離焦背景的干擾， 因此在恢復(fù)物體表面三維形貌高度中具有十分顯著的優(yōu)勢(shì)， 利用“shape from focus”算法，可以在橫向?qū)崿F(xiàn)高分辨率的形貌解析度[21，23，24]. 對(duì)于三維圖像中的某一點(diǎn) (x，y，z)， 其在每一層光切片圖像中都對(duì)應(yīng)同一個(gè)像素坐標(biāo)(x，y)， 根據(jù)光切片層數(shù)的不同， 該像素坐標(biāo)(x，y)的光強(qiáng)也不同，只有當(dāng)該點(diǎn)處于焦面位置時(shí)才有光強(qiáng)的最大值. 通過尋找亮度的最大值， 即可獲得該點(diǎn)的高度信息，即:

其中，h(x， y)代表 (x，y)坐標(biāo)處的高度;I(x，y，z)代表(x，y，z)處的光強(qiáng); argzmax代表取光強(qiáng)最大時(shí)的軸向位置， 即高度信息. 利用(35)式分別計(jì)算圖7(c)和圖7(f)的三維形貌分布并進(jìn)行定量對(duì)比，圖7(d)和圖7(g)是對(duì)應(yīng)的三維形貌分布圖， 圖中不同的顏色代表不同的高度. 兩種算法計(jì)算得到的形貌分布完全一致， 但HT-COS算法具有更快的圖像處理速度， 因此更適合大尺寸物體的三維成像.

表 1 兩種SIM彩色光切片算法的性能比較Table 1. Performance comparison of two algorithms for color optical sectioning SIM.

4 結(jié) 論

本文提出了一種基于希爾伯特變換的結(jié)構(gòu)光照明快速彩色三維顯微成像方法(HT-COS)， 與已有的HSV-RMS算法相比， HT-COS算法圖像采集量減少了1/3， 圖像處理時(shí)間節(jié)約了約28%. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， 該方法在圖像對(duì)比度、色彩還原度及形貌高度恢復(fù)等方面與HSV-RMS算法并無明顯差異， 該方法對(duì)大尺寸樣品的高分辨率三維彩色成像具有重要的意義， 將進(jìn)一步擴(kuò)展SIM的應(yīng)用范圍.

感謝中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所白明研究員提供的昆蟲樣品.