張婧怡，肖 俊，梁軍能，王婧杰,，張 旭,，羅永巨,**

(1.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530004；2.廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院，廣西南寧 530021)

0 引言

羅非魚具有食性廣、環(huán)境適應(yīng)性和抗病能力強(qiáng)等特點(diǎn)，是主要的水產(chǎn)養(yǎng)殖種類之一。池塘養(yǎng)殖是我國淡水養(yǎng)殖業(yè)最重要的養(yǎng)殖模式。2018年我國池塘養(yǎng)殖面積為266.68萬hm2，占全國淡水養(yǎng)殖面積的51.82%，同年我國淡水養(yǎng)殖產(chǎn)量為2 959.84萬t，池塘養(yǎng)殖產(chǎn)量為2 210.97萬t，占全國淡水養(yǎng)殖產(chǎn)量的74.70%[1]。近年來，稻魚綜合種養(yǎng)生態(tài)養(yǎng)殖技術(shù)得到廣泛應(yīng)用，主要是由于該技術(shù)能夠有效利用稻魚互利共生的關(guān)系，改善養(yǎng)殖生態(tài)條件，對提高水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)社會(huì)效益具有重要作用。

動(dòng)物的腸道菌群組成與其生活的環(huán)境因子、生理狀態(tài)和發(fā)育階段等因素有著密切聯(lián)系[2-4]。水生動(dòng)物生活在水環(huán)境中，其消化道短，腸道菌群的相對豐度容易受到外界環(huán)境的影響，進(jìn)而也會(huì)影響?zhàn)B殖動(dòng)物健康及其腸道微生物組成[5-6]。腸道微生物在魚類的生長發(fā)育過程中起著非常重要的作用，既能參與機(jī)體自身營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，同時(shí)也可調(diào)控機(jī)體的防御功能，從而促進(jìn)魚類的健康發(fā)育。李存玉等[7]在池塘和工廠化兩種不同養(yǎng)殖條件下養(yǎng)殖牙鲆，發(fā)現(xiàn)牙鲆的腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)差別很大，菌群豐度與多樣性差異明顯，不同養(yǎng)殖環(huán)境對牙鲆腸道微生物的影響不同；Li等[8]采用16S rRNA克隆文庫方法，對實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)殖條件下的南美白對蝦腸道細(xì)菌進(jìn)行多樣性研究，發(fā)現(xiàn)南美白對蝦腸道的16S rRNA克隆文庫中126個(gè)克隆子分屬2個(gè)不同的細(xì)菌類群:變形菌門和厚壁菌門；佟延南等[9]研究發(fā)現(xiàn)，羅非魚腸道內(nèi)乳球菌屬隨養(yǎng)殖周期的推移呈現(xiàn)下降趨勢，芽孢桿菌屬、假單胞菌屬和分枝桿菌屬呈先增后減的變化趨勢，梭菌屬和鄰單胞菌屬在養(yǎng)殖前期所占比例最高。之前的研究主要集中在養(yǎng)殖環(huán)境和飼料添加對魚類腸道微生物的影響方面，對其腸道微生物分布情況的研究比較匱乏[10]。因此，本實(shí)驗(yàn)采用16S rRNA高通量測序技術(shù)，對池塘和稻田兩種不同養(yǎng)殖環(huán)境下，羅非魚腸道菌群組成變化進(jìn)行研究，為不同養(yǎng)殖方式下羅非魚腸道微生物生理學(xué)研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及養(yǎng)殖

實(shí)驗(yàn)魚分為稻田組(DT組)和池塘組(CT組)兩組，分別養(yǎng)殖于隆安縣那桐鎮(zhèn)定江村定典屯水稻研究所實(shí)驗(yàn)基地和國家級羅非魚良種場(廣西壯族自治區(qū)水產(chǎn)科學(xué)研究院武鳴基地)，養(yǎng)殖魚苗規(guī)格均為150—200 g，同一天投放，投放密度為3 000尾/hm2，每天投喂羅非魚2次，上午、下午各一次。

1.2 取樣方法

在基地每隔30 d檢測養(yǎng)殖水體的水溫、溶氧(DO)、pH值和氨氮(納氏試劑比色法)。

養(yǎng)殖202 d后，每組隨機(jī)選取健康無病、體格相近的實(shí)驗(yàn)魚3尾(分別記為稻田組DT1、DT2、DT3，池塘組CT1、CT2、CT3)，經(jīng)測量，體長為(20.0±3.5) cm，體質(zhì)量為(400±26) g。使用間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽(MS-222)對其深度麻醉，用70%乙醇擦拭羅非魚體表，解剖羅非魚后取腸道微生物置于2 mL凍存管中，隨即投入液氮中速凍，后置-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR擴(kuò)增及基因文庫構(gòu)建

通過16S rRNA高通量測序檢測其腸道微生物。

1.3.1 基因組DNA的提取和PCR擴(kuò)增

采用CTAB方法[11]對樣本基因組DNA進(jìn)行提取，并利用瓊脂糖凝膠電泳檢DNA純度和濃度，取適量的樣本DNA于離心管中，使用無菌水稀釋至1 ng/μL。以稀釋后的基因組DNA為模板，根據(jù)測序區(qū)域的選擇，使用帶Barcode的特異引物(表1)，New England Biolabs公司的Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer和高效高保真酶進(jìn)行PCR，確保擴(kuò)增效率和準(zhǔn)確性。

表1 細(xì)菌16S引物及其對應(yīng)區(qū)域

Table 1 Primers of bacterial 16S and their corresponding regions

區(qū)域Region引物名稱Primer name引物序列(5'→3')Primer sequence (5'→3')V4515FGTGCCAGCMGCCGCGGTAA806RGGACTACHVGGGTWTCTAATV3V4341FCCTAYGGGRBGCASCAG806RGGACTACNNGGGTATCTAAT

注：下劃線部分為Barcode序列

Note:Barcode sequence is underlined

1.3.2 PCR產(chǎn)物的混樣和純化

根據(jù)濃度進(jìn)行將上述PCR產(chǎn)物等量混樣，充分混勻后使用1×TAE 濃度2%的瓊脂糖凝膠電泳純化PCR混合產(chǎn)物，再用Thermo Scientific 公司的GeneJET膠回收試劑盒回收產(chǎn)物。

1.3.3 基因文庫構(gòu)建

使用Thermofisher公司的Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建庫試劑盒，參照試劑盒說明書進(jìn)行基因文庫的構(gòu)建。

1.4 測序分析

1.4.1 數(shù)據(jù)處理

所有測序分析均由生工生物公司完成。Barcode序列是Miseq測序序列中的一種，主要是對reads中的數(shù)據(jù)進(jìn)行拆分，此外還有一種接頭序列[12]。在對測序的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理時(shí)，需要將引物接頭序列去除。此外，存在于PE reads之間的overlap關(guān)系可以將成對的reads[13]整合成一條序列，通過Barcode標(biāo)簽可將相應(yīng)的序列識別出來，進(jìn)而得到各種各樣的樣本數(shù)據(jù)。為了確保樣本數(shù)據(jù)的有效性，需對這些樣本數(shù)據(jù)的質(zhì)量進(jìn)行控制和過濾，從而得到實(shí)驗(yàn)最終所需的樣本數(shù)據(jù)[14]。稀釋曲線采用Mothur v1.30進(jìn)行分析。

1.4.2 OUTs聚類和物種注釋

利用Uparse軟件[15]對所有樣品的全部Clean Reads進(jìn)行聚類，默認(rèn)以97%的一致性(Identity)將序列聚類成為Operational Taxonomic Units(OTUs)，利用R語言工具制作Rank Abundance曲線圖，同時(shí)依據(jù)其算法原則，篩選OTUs中出現(xiàn)頻數(shù)最高的序列作為代表序列。

用Mothur方法與SILVA132[16]的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫[17]對OTUs序列進(jìn)行物種注釋分析(設(shè)定閾值為0.8—1.0)，獲得分類學(xué)信息并分別在門(Phylum)和屬(Genus)水平統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成。使用MUSCLE[18]軟件進(jìn)行快速多序列比對，得到所有OTUs序列的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。最后以樣品中數(shù)據(jù)量最少的為標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行均一化處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 水質(zhì)變化情況

稻田和池塘水質(zhì)參數(shù)比較如圖1所示。結(jié)果顯示，養(yǎng)殖水質(zhì)參數(shù)均在正常范圍內(nèi)，兩種環(huán)境下，溶氧、水溫、pH值差異不大，氨氮參數(shù)有顯著差異。

圖1 稻田和池塘溶氧、水溫、pH值、氨氮參數(shù)比較(P<0.05)

Fig.1 Comparison of dissolved oxygen，water temperature，pH，ammonia nitrogen parameters between rice field and pond (P<0.05)

2.2 腸道菌群α多樣性分析結(jié)果

實(shí)驗(yàn)樣本稀釋曲線斜率隨測序通量的增大而逐漸降低，最終趨于平穩(wěn)(圖2)。Rank abundance曲線反映出兩組羅非魚的腸道內(nèi)物種分布均勻(圖3)。綜上所述，隨著測序深度的增加，測序量已飽和且測序數(shù)據(jù)量合理，各樣本中幾乎所有細(xì)菌序列均被檢測出。2個(gè)實(shí)驗(yàn)組樣品的菌群α多樣性因養(yǎng)殖環(huán)境的不同而存在差異。

圖2 不同實(shí)驗(yàn)組羅非魚腸道內(nèi)容物樣本的稀釋曲線

Fig.2 Dilution curves of tilapia intestinal contents samples from two experimental groups

圖3 Rank abundance曲線

2.3 腸道菌群結(jié)構(gòu)

2.3.1 門水平下的腸道菌群結(jié)構(gòu)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，梭桿菌門(Fusobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)在稻田組和池塘組羅非魚腸道菌群中相對豐度均較高，藍(lán)菌門(Cyanobacteria)在稻田組的相對豐度較高，擬桿菌門(Bacteroidetes)和放線菌門(Actinobacteria)在池塘組的相對豐度較高(圖4)。表明不同養(yǎng)殖環(huán)境下羅非魚腸道菌群種類相似，菌群的相對豐度有差異。變形菌門、擬桿菌門、梭桿菌門、厚壁菌門以及放線菌門的相對豐度都發(fā)生不同程度的變化。其中池塘組的羅非魚腸道梭桿菌門相對豐度低于稻田組，變形菌門相對豐度高于稻田組，其他優(yōu)勢菌門之間也存在差異。

圖4 門水平下不同實(shí)驗(yàn)組羅非魚腸道菌群的相對豐度

Fig.4 Relative abundance of tilapia intestinal flora at the phyla level in different test groups

2.3.2 屬水平下的腸道菌群結(jié)構(gòu)

研究發(fā)現(xiàn)，Cetobacterium，Paeniclostrdium和Romboutsia等菌屬在稻田組羅非魚腸道菌群相對豐度較高，池塘組羅非魚腸道菌群相對豐度較高的菌屬為Cetobacterium，Enterovibrio和Plesiomonas等；Cetobacterium在稻田組和池塘組的相對豐度最高，均占50%以上；Paeniclostrdium占稻田組的相對豐度高于池塘組，Plesiomonas在池塘組中相對豐度較高，但在稻田組中所占比例較小(圖5)。

圖5 屬水平下不同實(shí)驗(yàn)組羅非魚腸道菌群的相對豐度

Fig.5 Relative abundance of tilapia gut flora at the genus level in different test groups

3 討論

3.1 水質(zhì)參數(shù)的影響

本研究結(jié)果顯示，養(yǎng)殖水質(zhì)參數(shù)均在正常范圍內(nèi)，兩種環(huán)境下，溶氧、水溫、pH值差異不大，氨氮參數(shù)有顯著差異，這可能是因?yàn)榧s化、高密度養(yǎng)殖以及飼料的過度使用，造成水體中氨氮含量升高，引起水體富營養(yǎng)化，對環(huán)境產(chǎn)生污染，從而影響羅非魚的生長發(fā)育，導(dǎo)致羅非魚腸道微生物的結(jié)構(gòu)組成和多樣性發(fā)生變化。張皓[5]通過高通量測序技術(shù)調(diào)查了南美白對蝦、鯉科魚養(yǎng)殖池塘水體、底泥、腸道微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的變化發(fā)現(xiàn)，水體中的氨氮、化學(xué)需氧量及總氮對水體中細(xì)菌種群影響最大，對水生動(dòng)物腸道微生物種群結(jié)構(gòu)也產(chǎn)生相互影響。這說明水體中的氨氮會(huì)影響?zhàn)B殖水體中細(xì)菌種群的數(shù)量，進(jìn)而影響腸道菌群的組成和多樣性。

3.2 腸道菌群結(jié)構(gòu)

微生物具有調(diào)控養(yǎng)殖環(huán)境的能力，對水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)的健康至關(guān)重要[19]。腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)、功能與羅非魚的營養(yǎng)代謝、免疫防御、胃腸道發(fā)育等生理過程密切相關(guān)，是維持機(jī)體腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要因素，在羅非魚健康養(yǎng)殖過程中發(fā)揮著重要作用[20]。根據(jù)腸道菌群α多樣性分析結(jié)果可看出，本實(shí)驗(yàn)測序數(shù)據(jù)量充足，池塘養(yǎng)殖和稻田養(yǎng)殖的羅非魚腸道中物種均勻度高，物種豐富。兩個(gè)環(huán)境組的樣品菌群多樣性因養(yǎng)殖環(huán)境不同存在差異，說明不同養(yǎng)殖環(huán)境下，羅非魚的腸道微生物多樣性有明顯變化。

隨著二代測序技術(shù)和生物信息學(xué)分析的應(yīng)用，大量魚類腸道菌群逐漸被發(fā)現(xiàn)，主要包括變形菌門(Proteobacteria)、梭桿菌門(Fusobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)、梭狀芽孢桿菌門(Clostridia)、桿菌門(Bacilli)和疣微菌門(Verrucomicrobia)[21-23]。其中，這些優(yōu)勢菌群在不同魚類的腸道菌群中占90%以上，且對魚類腸道功能起著不可替代的影響和作用[24]。本實(shí)驗(yàn)對不同養(yǎng)殖環(huán)境下羅非魚腸道菌群變化情況進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn)，變形菌門、厚壁菌門和擬桿菌門在不同養(yǎng)殖環(huán)境條件下的羅非魚腸道菌群中相對豐度較高，藍(lán)細(xì)菌門在稻田組腸道菌群相對豐度較高，梭桿菌門和放線菌門在池塘組腸道菌群相對豐度較高。表明不同養(yǎng)殖環(huán)境下羅非魚腸道菌群分布情況存在一定差異，這可能是由于魚類的腸道微生物與水體環(huán)境密切相關(guān)，容易受到食物和環(huán)境變化等影響[2]。梭桿菌門、變形菌門[25-27]、厚壁菌門[28]和擬桿菌門[29]是羅非魚腸道中的優(yōu)勢菌群，這一結(jié)果與鯉魚、虹鱒[30]及金鯧[31]腸道菌群多樣性規(guī)律一致。Lyons等[32]和Ye等[33]研究發(fā)現(xiàn)，優(yōu)勢菌群與宿主的健康和營養(yǎng)息息相關(guān)，優(yōu)勢菌群會(huì)影響宿主自身微生物的組成、群落結(jié)構(gòu)以及菌落結(jié)構(gòu)，而腸道菌群結(jié)構(gòu)的失衡也有可能會(huì)導(dǎo)致宿主疾病的產(chǎn)生，但其在不同魚類腸道中所發(fā)揮的作用有待進(jìn)一步證實(shí)。

屬水平下，不同養(yǎng)殖環(huán)境的羅非魚腸道菌群相對菌屬分布情況存在差異，稻田組羅非魚腸道菌群相對豐度較高的菌屬是Cetobacterium，Paeniclostrdium和Romboutsia等，而池塘組相對豐度較高菌屬是Cetobacterium，Enterovibrio和Plesiomonas等。大量研究發(fā)現(xiàn)，Cetobacterium是淡水魚類微生物群的組成部分[34]，例如Tsuchiya等[35]和Van等[36]研究發(fā)現(xiàn)，Cetobacterium和Plesiomonas在各養(yǎng)殖階段羅非魚腸道菌群數(shù)量均占2.00%，是羅非魚腸道菌群的重要組成成分，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。本研究還發(fā)現(xiàn)，池塘組和稻田組羅非魚含有大量的未知菌屬，還需要后續(xù)的深入研究。

魚類腸道微生物的數(shù)量、群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境、餌料和發(fā)育等因素密切相關(guān)，具體表現(xiàn)為養(yǎng)殖水體中的微生物、鹽度、水溫，魚類攝食的餌料、藥物及其生理狀態(tài)和發(fā)育階段對魚類消化道菌群結(jié)構(gòu)均有影響[21,37]。該結(jié)論可為羅非魚腸道益生菌的篩選提供科學(xué)依據(jù)，并倡導(dǎo)羅非魚養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中微生物制劑的科學(xué)使用，減少藥殘對生態(tài)環(huán)境的污染，改善羅非魚的生長性能及品質(zhì)。