王 悅 徐獻(xiàn)忠 劉 銘 劉夢(mèng)云

(鄭州大學(xué)力學(xué)與安全工程學(xué)院，鄭州450001)

細(xì)胞是構(gòu)成生物體的基本單位，也是能夠產(chǎn)生力的主動(dòng)力學(xué)系統(tǒng)[1]。在生物體成長(zhǎng)的過(guò)程中，細(xì)胞不停地承受由外部環(huán)境或內(nèi)部環(huán)境引起的力學(xué)刺激，并通過(guò)改變自己的生物學(xué)行為(例如生長(zhǎng)、分化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達(dá)和細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生的改變等)來(lái)對(duì)這些刺激作出積極的響應(yīng)。當(dāng)力學(xué)刺激超過(guò)細(xì)胞的適應(yīng)能力時(shí)，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷、病變或死亡。因此，研究細(xì)胞的力學(xué)性能，對(duì)于理解細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，探索細(xì)胞行為內(nèi)在機(jī)制具有十分重要的意義。

過(guò)去幾十年，許多學(xué)者已經(jīng)對(duì)細(xì)胞的生物力學(xué)特性進(jìn)行了大量的探索研究，特別是單細(xì)胞的力學(xué)信息越來(lái)越受到重視[2-5]。通過(guò)對(duì)不同種類單細(xì)胞的監(jiān)測(cè)和實(shí)驗(yàn)，得到形態(tài)結(jié)構(gòu)、物理特性的變化，從而為量化藥物、檢測(cè)和識(shí)別細(xì)胞提供了有價(jià)值的見(jiàn)解[6-8]。事實(shí)上，在微觀尺度對(duì)種類繁多且形態(tài)各異的細(xì)胞進(jìn)行研究是一個(gè)較大的難題。隨著科技的發(fā)展和研究的深入，人們建立了一系列實(shí)驗(yàn)方法和力學(xué)模型來(lái)對(duì)細(xì)胞的性質(zhì)進(jìn)行表征。常用的實(shí)驗(yàn)方法有微吸管、光鑷、磁鑷、光學(xué)展寬器、原子力顯微鏡等，可以在納米尺度上對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行操作。力學(xué)模型大致分為微結(jié)構(gòu)模型和連續(xù)介質(zhì)模型兩大類，分別從不同角度解釋細(xì)胞的力學(xué)響應(yīng)，并將其轉(zhuǎn)化為數(shù)學(xué)表征。雖然如此，在關(guān)于細(xì)胞變形行為的解釋，細(xì)胞膜表面的應(yīng)力應(yīng)變分布，不同細(xì)胞力學(xué)特性參數(shù)的對(duì)比等方面，這些實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ腿匀淮嬖谥T多不足和挑戰(zhàn)。因此，本文基于細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)理論和細(xì)胞壓痕實(shí)驗(yàn)提出了一種可用于分析細(xì)胞壓痕實(shí)驗(yàn)中變形的力學(xué)模型，并根據(jù)幾何相似性原理，通過(guò)宏觀球體壓痕試驗(yàn)對(duì)模型進(jìn)行了模擬和驗(yàn)證，從而為單細(xì)胞的生物力學(xué)研究提供一種新的思路。

1 理論模型

細(xì)胞主要由細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核以及其他細(xì)胞器組成。當(dāng)細(xì)胞受到力學(xué)刺激時(shí)，各個(gè)組成部分都會(huì)產(chǎn)生機(jī)械抵抗進(jìn)而形成整體的力學(xué)響應(yīng)。然而，機(jī)械力從細(xì)胞膜傳遞到細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核以及其他細(xì)胞器的過(guò)程是動(dòng)態(tài)且復(fù)雜的，目前對(duì)其內(nèi)在機(jī)制的理解還不夠清晰。

在單細(xì)胞力學(xué)特性研究中，壓痕實(shí)驗(yàn)是應(yīng)用較為廣泛的測(cè)量方法。由于細(xì)胞小而柔軟，壓頭或探針常常被設(shè)計(jì)成球形，以保證實(shí)驗(yàn)過(guò)程中細(xì)胞不受到損傷。在對(duì)壓痕實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合分析時(shí)，Hertz模型形式簡(jiǎn)單，應(yīng)用較為廣泛。例如，吳志超[9]用自制的小球探針在液態(tài)環(huán)境下對(duì)轉(zhuǎn)移性不同的肺癌細(xì)胞進(jìn)行了納米壓痕實(shí)驗(yàn)，并利用Hertz 接觸方程對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了非線性擬合，研究了細(xì)胞的力學(xué)特性參數(shù)對(duì)癌變轉(zhuǎn)移的影響；Nguyen等[10]利用原子力顯微鏡(atomic force microscopy, AFM)研究了單個(gè)軟骨細(xì)胞的黏彈性特性，探討了細(xì)胞內(nèi)液體對(duì)細(xì)胞力學(xué)響應(yīng)的重要作用。然而，該模型基于一般工程材料的均質(zhì)線彈性和小應(yīng)變假設(shè)，無(wú)法充分體現(xiàn)細(xì)胞的力學(xué)特性，且由于壓痕深度與細(xì)胞高度相差不大，數(shù)據(jù)的擬合還會(huì)產(chǎn)生較大偏差。由于許多懸浮細(xì)胞、剛傳代的癌細(xì)胞[11]、軟骨細(xì)胞等都呈球狀，可將細(xì)胞簡(jiǎn)化為一個(gè)內(nèi)部充滿液體，外部由不可壓縮、均質(zhì)、各向同性的球形膜包裹的實(shí)體。根據(jù)生物膜的結(jié)構(gòu)及常用處理方法[12]，我們假設(shè)：(1) 細(xì)胞呈球形，變形前后均為旋轉(zhuǎn)對(duì)稱體。(2) 細(xì)胞膜由不可壓縮、均質(zhì)、各向同性的材料組成，變形前厚度均一。(3)細(xì)胞質(zhì)不可壓縮，即細(xì)胞體積不變。因此，在本文的細(xì)胞模型中，細(xì)胞膜的材料屬性是可變的，對(duì)于壓痕深度也沒(méi)有明確的限制，更貼近于壓痕實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞的真實(shí)情形。

為了模擬細(xì)胞的變形，我們首先取出一個(gè)微分膜單元(圖1)進(jìn)行受力分析，柱坐標(biāo)(ρ,η,?)用來(lái)定義膜變形后的形狀[13]。xm和xc是該膜單元的主軸；s是沿著經(jīng)線方向的弧長(zhǎng)；θ表示膜表面任意一點(diǎn)的法線與η軸的夾角。Rm和Rc表示主曲率半徑；Tmm和Tcc表示主張力；Tmc是剪切力；σm和σc是膜單元在xm和xc方向上受到的凈剪切應(yīng)力；P是作用在膜單元法線方向上的凈壓力。

圖1 膜單元的受力分析

對(duì)于生物細(xì)胞而言，其半徑通常遠(yuǎn)大于膜的厚度，由板殼理論可知，當(dāng)膜厚很小時(shí)，彎曲剛度對(duì)變形的貢獻(xiàn)可以忽略。當(dāng)微分膜單元平衡時(shí)，其在三個(gè)垂直獨(dú)立方向上的合力為零，即

其中，m，c，n分別表示膜單元在經(jīng)線，緯線以及法線方向上的相應(yīng)分量。代入關(guān)系式dxm=ρd?以及dxc= ds，可得軸對(duì)稱膜的平衡方程為

在細(xì)胞壓痕試驗(yàn)中，力通常對(duì)稱加載到細(xì)胞表面上。此時(shí)，σc和Tmc都為零，從而上述平衡方程可以簡(jiǎn)化為

其中，Tm和Tc為主張力；Km和Kc為主曲率。主張力依賴于所選擇的表征細(xì)胞膜屬性的本征材料，且可以表示為細(xì)胞形狀以及材料特性的函數(shù)，主曲率取決于細(xì)胞的形態(tài)，因此，求得細(xì)胞的形態(tài)變化是描述細(xì)胞膜應(yīng)力變化的關(guān)鍵。

圖2 為細(xì)胞變形前后的幾何模型示意圖。我們用球坐標(biāo)(r,θ,ψ)來(lái)描述細(xì)胞變形前的形狀(細(xì)實(shí)線部分)，用柱坐標(biāo)(ρ,θ,η)來(lái)描述變形后的形狀(粗實(shí)線部分)，根據(jù)幾何關(guān)系可得

式中，γ為球心連線與η軸的夾角；ρB為細(xì)胞與基底的接觸半徑；RJ是以J點(diǎn)為球心的球體半徑；ηE是E點(diǎn)在η軸上的坐標(biāo)距離。壓痕深度(等同于細(xì)胞在豎直方向上的整體變形)與細(xì)胞結(jié)構(gòu)尺寸之間的關(guān)系可表示為

式中，h為壓痕深度；R為細(xì)胞初始半徑；r為球形壓頭半徑。變形前的球形細(xì)胞體積為

由旋轉(zhuǎn)對(duì)稱可得變形后的細(xì)胞體積

其中，V1，V2分別為平面圖形ABCDK與EDGF繞η軸旋轉(zhuǎn)構(gòu)成旋轉(zhuǎn)體的體積；V3為壓頭底部球缺的體積。

圖2 壓痕試驗(yàn)過(guò)程細(xì)胞整體變形的幾何模型

根據(jù)細(xì)胞體積不變假設(shè)，式(10)與式(11)相等，聯(lián)立式(7)～式(14)即為細(xì)胞變形的方程組。在具體條件下給定細(xì)胞初始半徑R和壓頭半徑r，求解可得細(xì)胞的幾何尺寸變化。

根據(jù)變形前后坐標(biāo)的定義有

主 曲 率Km和Kc以 及 主 伸 長(zhǎng) 比λm和λc可 以 表述如下

其中，撇號(hào)在文中均代表對(duì)角度ψ的導(dǎo)數(shù)，符號(hào)“±”應(yīng)確保相應(yīng)值為正。

在圖2中，施加外力的AB和EL段定義為接觸區(qū)，其他區(qū)域如BC，CD，DE段稱為非接觸區(qū)。對(duì)于AB段，接觸面為平面，則需滿足

對(duì)于EL段，接觸面為壓頭的球冠，需滿足

由于力平衡，接觸區(qū)的凈壓力P等于零，在式(20)成立的前提下平衡方程式(6)自動(dòng)滿足，但方程式(5)仍然有效。不考慮壓頭與細(xì)胞膜之間的摩擦，也就是σm=0。聯(lián)立方程式(5)和式(6)，式(16)～式(21)，最終可得接觸區(qū)AB段的控制方程為

接觸區(qū)EL段的控制方程為

對(duì)非接觸區(qū)有

其中，“+”用于BC和CD段，“?”用于DE段?？刂品匠淌?22)～式(28)中，δ=λcsinψ，f1=?Tm/?λm，f2=?Tm/?λc，f3=Tc?Tm。在具體條件下，給定細(xì)胞的材料特性，由細(xì)胞的幾何模型計(jì)算得到細(xì)胞的幾何尺寸，從而確定控制方程的邊界條件及中間點(diǎn)的值，再利用標(biāo)準(zhǔn)四階Runge–Kutta法即可求解得到細(xì)胞的變形，細(xì)胞內(nèi)的壓力，細(xì)胞膜表面應(yīng)力及張力分布等信息。特別的，壓痕力可以表示為

由此可以得到力–變形曲線，不同的細(xì)胞屬性將會(huì)產(chǎn)生不同的力–變形關(guān)系。

2 球體壓痕試驗(yàn)

2.1 材料與設(shè)備

在細(xì)胞壓痕試驗(yàn)中，對(duì)于細(xì)胞變形信息的直接測(cè)定是非常困難的，而應(yīng)力應(yīng)變的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)更是具有挑戰(zhàn)性。相比于微觀的細(xì)胞，若能夠在宏觀尺度下進(jìn)行研究，找到跨尺度的聯(lián)系，就可以在一定程度上降低試驗(yàn)難度、提高試驗(yàn)精度，并作為一種補(bǔ)充手段與細(xì)胞壓痕相互印證。根據(jù)幾何相似性原理，我們選用彈性良好的乳膠球和聚氯乙烯(PVC)球進(jìn)行試驗(yàn)，并在分析部分通過(guò)細(xì)胞理論模型進(jìn)行驗(yàn)證，試驗(yàn)材料的選擇和加載條件的設(shè)置均可看作是對(duì)細(xì)胞壓痕試驗(yàn)的模擬。

實(shí)驗(yàn)設(shè)備有華龍萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)，靜態(tài)應(yīng)變測(cè)試分析系統(tǒng)等。由于在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中球體所產(chǎn)生的變形遠(yuǎn)大于常規(guī)應(yīng)變片的量程，且球面為曲面，無(wú)法直接進(jìn)行測(cè)量。為此，我們?cè)O(shè)計(jì)制作了一種柔性變形傳感器(圖3(a))：(1)將應(yīng)變片焊接于長(zhǎng)條狀薄金屬片表面；(2)用強(qiáng)力膠水將彈力線分別粘貼在金屬片兩端，在室溫下靜置一段時(shí)間以便膠水固化；(3)制作完成后，利用萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)對(duì)其進(jìn)行拉伸標(biāo)定，將應(yīng)變儀采集到的應(yīng)變信號(hào)轉(zhuǎn)化成傳感器的變形信息(圖3(b)顯示了其中一組標(biāo)定結(jié)果)。試驗(yàn)時(shí)，將這種柔性變形傳感器環(huán)繞在球體表面即可監(jiān)測(cè)曲面變形。

圖3 傳感器的制作與標(biāo)定

2.2 試驗(yàn)過(guò)程

球體壓痕試驗(yàn)共設(shè)置了4 種變量，分別是球體的材料(乳膠或PVC，對(duì)應(yīng)于細(xì)胞類型)，球體周長(zhǎng)(分別為620 mm，640 mm，660 mm，700 mm，對(duì)應(yīng)于細(xì)胞大小)，加載速率和壓痕深度。試驗(yàn)中將柔性變形傳感器固定在球體赤道線處，用萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)分別對(duì)每種情況下的球體進(jìn)行壓痕試驗(yàn)，利用靜態(tài)應(yīng)變測(cè)試分析系統(tǒng)采集試驗(yàn)過(guò)程中的應(yīng)變信號(hào)，并將其轉(zhuǎn)化為球體赤道周長(zhǎng)的變形信息。圖4(a)和圖4(b)分別為乳膠球(周長(zhǎng)700 mm)壓痕試驗(yàn)和PVC 球(周長(zhǎng)640 mm)壓痕試驗(yàn)。

圖4 壓痕試驗(yàn)

3 結(jié)果與分析

圖5 給出了不同球體的壓痕曲線(圖例給出了球體的周長(zhǎng))。從圖5 中可以看出，相同的材料，對(duì)于同樣大小的壓頭，壓痕力隨球體變大而減小，其原因可能是對(duì)于同樣的壓痕深度，較小的球體內(nèi)壓較高，因此需要更大的壓痕力。除此之外，PVC球的壓痕力明顯大于乳膠球的壓痕力，這是因?yàn)镻VC球的膜較厚(1.25 mm)，其抗拉剛度大于乳膠球膜，PVC球膜從手感上比乳膠球更硬一些，也說(shuō)明了這一點(diǎn)。

圖5 不同球體的壓痕曲線

在不同的加載條件下，利用Matlab求解球體變形方程組。輸入球體半徑R和壓頭半徑r，計(jì)算得到接觸半徑ρB和兩側(cè)球體半徑RJ，再由式(30)可得球體赤道處的理論變形

圖6顯示了周長(zhǎng)660 mm、加載速率150 mm/min、壓痕深度60 mm 的乳膠球的理論計(jì)算結(jié)果與壓痕試驗(yàn)測(cè)得的球體實(shí)際變形。趨勢(shì)線的比例系數(shù)和擬合系數(shù)R2表征了理論計(jì)算結(jié)果與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的吻合程度，二者越接近于1，吻合程度越高。從圖6可以看出，理論模型能夠較好地描述該組試驗(yàn)中球體的變形。經(jīng)過(guò)對(duì)各組試驗(yàn)擬合結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，趨勢(shì)線的比例系數(shù)取值在0.98～1.01 之間，擬合系數(shù)均在0.99 以上。由此證明本文提出的細(xì)胞壓痕理論分析模型可以很好地描述乳膠球和PVC 球的變形行為。

由于細(xì)胞的材料屬性呈現(xiàn)高度非線性，不能使用簡(jiǎn)單的彈性模量來(lái)表征?；诶碚摬糠謱?duì)細(xì)胞膜作出的均質(zhì)、各向同性及不可壓縮假設(shè)，可用應(yīng)變能密度函數(shù)來(lái)表示其本構(gòu)關(guān)系。對(duì)于試驗(yàn)中的乳膠球和PVC球，選用Mooney–Rivlin本構(gòu)模型來(lái)描述它們的材料特性[14]，其函數(shù)表達(dá)式為

其中，W表示應(yīng)變能；C10和C01是材料常數(shù)，單位與應(yīng)力相同。對(duì)于彈性材料，E=6(C10+C01)。I1和I2是應(yīng)變不變量，且可以表示成主伸長(zhǎng)比的函數(shù)

膜的主應(yīng)力σi和主張力Ti可由應(yīng)變能密度函數(shù)表示為

其中，t為膜的厚度。將式(35)代入式(22)～式(28)中，根據(jù)幾何模型得到的邊界條件求解。

圖6 球體赤道線的變形隨壓痕深度的變化

對(duì)于周長(zhǎng)620 mm、壓痕深度70 mm 的乳膠球，模型參數(shù)為C10= 0.23 MPa，C01= 0.19 MPa，t= 0.16 mm，圖7 顯示了球體壓痕力隨壓痕深度變化的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和模擬結(jié)果，較高的吻合度進(jìn)一步說(shuō)明了細(xì)胞模型的適用性。將材料參數(shù)換算成楊氏模量，則E乳膠=2.52 MPa，EPVC=4.11 MPa。

圖7 球體壓痕力隨壓痕深度的變化

為了驗(yàn)證宏觀(球體)試驗(yàn)的有效性，分別將一組PVC 球和幾種細(xì)胞的壓痕曲線進(jìn)行歸一化處理(見(jiàn)圖8，數(shù)據(jù)分別來(lái)源于PVC球壓痕試驗(yàn)和參考文獻(xiàn))。從圖8中可以看出，PVC球與淋巴瘤細(xì)胞[15]、Anip-973 肺癌細(xì)胞[9]及軟骨細(xì)胞[10]的力學(xué)響應(yīng)具有一定的相似性。因此，利用宏觀球體的壓痕試驗(yàn)去模擬細(xì)胞的力學(xué)行為是可行的，這種不同尺度下的類比研究方法作為一種補(bǔ)充手段，將會(huì)為單細(xì)胞的研究提供有價(jià)值的信息。

圖8 PVC 球和幾種細(xì)胞的歸一化壓痕曲線

圖9 給出了分別運(yùn)用Hertz 模型和細(xì)胞壓痕模型對(duì)單個(gè)軟骨細(xì)胞的壓痕曲線實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的擬合結(jié)果(模型參數(shù)分別為：R= 8.5μm，r= 2.5μm，C10=55.6 Pa，C01=11.12 Pa)。

結(jié)果顯示細(xì)胞壓痕模型的擬合系數(shù)R2高達(dá)0.999 2，而Hertz 模型的擬合系數(shù)僅有0.993 5，證明了細(xì)胞壓痕模型對(duì)于軟骨細(xì)胞力學(xué)特性描述的適用性。Hertz 模型在細(xì)胞大變形時(shí)忽略了尺寸效應(yīng)，計(jì)算結(jié)果表示的是作為均質(zhì)細(xì)胞假設(shè)的整體彈性性能，與細(xì)胞的真實(shí)力學(xué)響應(yīng)有一定差別；細(xì)胞壓痕模型的計(jì)算結(jié)果表示的是細(xì)胞膜的彈性性能，比較符合真實(shí)的細(xì)胞結(jié)構(gòu)及其變形行為。根據(jù)新的模型及計(jì)算理論，我們計(jì)算了當(dāng)壓痕深度為2μm時(shí)軟骨細(xì)胞細(xì)胞膜表面的應(yīng)力分布(如圖10所示)。

圖9 兩種模型對(duì)單個(gè)軟骨細(xì)胞壓痕曲線的擬合效果比較

圖10 細(xì)胞膜表面的應(yīng)力分布

結(jié)果表明膜表面的應(yīng)力并不均一且在赤道面和壓頭接觸面上有兩個(gè)明顯的峰值。由此可以推測(cè)，隨著壓痕深度及壓痕力的增大，細(xì)胞膜的破裂將會(huì)發(fā)生在赤道面或壓頭接觸面上，壓頭與細(xì)胞的相對(duì)大小決定了破裂的具體位置。

總之，本文提出的細(xì)胞力學(xué)模型能夠較好地描述壓痕實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞的力學(xué)響應(yīng)，通過(guò)對(duì)力–變形曲線的擬合能夠得到細(xì)胞的力學(xué)特性參數(shù)，進(jìn)一步分析可得細(xì)胞膜表面的應(yīng)力分布等。另外，對(duì)于模型中細(xì)胞的體積限制，只需要加入一個(gè)適當(dāng)取值的系數(shù)即可考慮生物膜的滲透效應(yīng)。

4 結(jié)論與展望

本文基于細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)理論和細(xì)胞壓痕實(shí)驗(yàn)提出了一種細(xì)胞力學(xué)模型，并通過(guò)宏觀球體(乳膠球和PVC 球)壓痕試驗(yàn)對(duì)細(xì)胞壓痕進(jìn)行了模擬，得到了表征不同球體膜力學(xué)特性的參數(shù)，驗(yàn)證了模型的適用性，同時(shí)展示出一種可用于細(xì)胞壓痕相關(guān)研究的新思路。目前理論模型通過(guò)預(yù)測(cè)細(xì)胞的形態(tài)變化，獲得細(xì)胞的材料屬性，進(jìn)一步分析可以得到細(xì)胞膜表面的應(yīng)力分布和細(xì)胞內(nèi)的壓強(qiáng)變化等參數(shù)?？傊?，細(xì)胞力學(xué)特性的研究是一個(gè)多尺度跨學(xué)科的長(zhǎng)期探索過(guò)程。由于活細(xì)胞的結(jié)構(gòu)異質(zhì)性和動(dòng)態(tài)復(fù)雜性，仍然需要加深對(duì)不同細(xì)胞結(jié)構(gòu)及其性質(zhì)的認(rèn)識(shí)，并嘗試建立統(tǒng)一的方法和理論體系，為生物材料、醫(yī)學(xué)、生命科學(xué)等領(lǐng)域的發(fā)展奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。