牛欣寧 王步軍

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所 / 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部谷物品質(zhì)監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心, 北京 100081

伏馬毒素(Fumonisins), 是由串珠鐮刀菌(Fusarium moniliforme)、輪狀鐮刀菌(Fusarium verticillioides)等在適宜的溫度和濕度條件下產(chǎn)生的一種次級(jí)代謝產(chǎn)物。到目前為止, 已發(fā)現(xiàn)A、B、C 和P 四大類共28 種伏馬毒素, FB1、FB2、FB3 三種最為常見(jiàn), 其中FB1 污染最多, 含量最高(約占60%)、毒性最強(qiáng)、對(duì)谷物的污染最為嚴(yán)重[1-2]。伏馬毒素易溶于甲醇、乙腈、水等極性溶劑, 具有極強(qiáng)的熱穩(wěn)定性, 廣泛存在于玉米、小麥、水稻等糧食作物及其加工制品中, 主要污染玉米及其制品, 可通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體及動(dòng)物體內(nèi), 引起各種疾病, 包括神經(jīng)毒性[3-5]、免疫毒性[6-10]、器官和組織毒性[11-14]、生殖毒性[15-16]、致癌性[17]等, 因此加強(qiáng)對(duì)糧食作物中伏馬毒素的監(jiān)測(cè)和控制格外重要。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)具有準(zhǔn)確的測(cè)量標(biāo)準(zhǔn), 可對(duì)量值溯源性、實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量保證能力及監(jiān)測(cè)體系進(jìn)行客觀評(píng)價(jià)[18]。我國(guó)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制起步比較晚, 尤其在生物毒素基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制方面與國(guó)外其他國(guó)家相比仍相對(duì)落后。生物毒素基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是指基體中有確定含量的生物毒素物質(zhì)?；w標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可以避免基質(zhì)中所存在的活性物質(zhì)與生物毒素產(chǎn)生反應(yīng), 對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生干擾。與純品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)相比, 基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為目標(biāo)化合物和基體結(jié)合, 與真實(shí)檢測(cè)樣品更一致, 可以保障測(cè)試結(jié)果的準(zhǔn)確性和質(zhì)量控制的有效性[19]。

國(guó)外伏馬毒素相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)價(jià)格昂貴, 且貨運(yùn)期長(zhǎng), 購(gòu)買(mǎi)不便, 遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足國(guó)內(nèi)對(duì)于伏馬毒素的檢測(cè)和質(zhì)量控制的需求。而我國(guó)“國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)資源共享平臺(tái)”上暫未查到有關(guān)伏馬毒素FB1 的基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì), 本次試驗(yàn)根據(jù)JJF 1006-1994《一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)規(guī)范》[20]、JJF 1343-2012《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的通用原則及統(tǒng)計(jì)學(xué)原理》[21]以及ISO 導(dǎo)則[22]研制了玉米粉中伏馬毒素FB1 基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì), 對(duì)于實(shí)驗(yàn)室中玉米及其加工品中伏馬毒素FB1 的檢測(cè)起到準(zhǔn)確性、可溯源性等重要作用。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

儀器包括： 超高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜(UPLC-XEVO TQ, 美國(guó)Waters 公司); THZ-300 恒溫培養(yǎng)搖床(上海一恒科學(xué)儀器公司); 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Sigma 公司); MILLI-Q 純水機(jī)(美國(guó)Millipore 公司);LGJ-10FD 真空冷凍干燥機(jī)(北京松源華興科技發(fā)展有限公司); V 型混合機(jī); 均質(zhì)分離機(jī); 渦旋混勻器; 氮吹儀;天平。

試劑包括： 甲醇、乙腈(色譜級(jí), 美國(guó)Fisher 公司); 甲酸(色譜級(jí), 美國(guó) Sigma 公司); 伏馬毒素標(biāo)準(zhǔn)品(美國(guó)Romer 公司)。玉米原料購(gòu)買(mǎi)自市場(chǎng)。

1.2 儀器條件

1.2.1 色譜條件 色譜柱為C18柱(100 mm×2.1 mm,粒徑1.6 μm); 柱溫40℃; 樣品溫度10℃; 進(jìn)樣體積為5 μL; 流動(dòng)相A： 甲醇(色譜級(jí)), 流動(dòng)相B： 0.1%的甲酸,流速為0.2 mL min-1; FB1 梯度洗脫程序0～5.5 min 流動(dòng)相A 由2%增加至85%, 5.5～5.6 min 流動(dòng)相A 降至2%, 平衡2.4 min。

1.2.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(electrospray ionization, ESI), 正離子模式; MRM 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式; 毛細(xì)管電壓2.50 kV; 離子源溫度110℃; 去溶劑氣流量800 L h-1;溶劑氣溫度為450℃。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制

將所購(gòu)玉米顆粒進(jìn)行伏馬毒素 FB1 毒素含量初檢,符合要求后按照一定比例添加一定濃度伏馬毒素FB1 標(biāo)準(zhǔn)溶液, 經(jīng)浸泡使之達(dá)到預(yù)期含量, 之后將樣品冷凍干燥、磨細(xì)粉, 過(guò)40 目篩, 充分混勻并分裝, 抽真空密封保存。

1.4 均勻性檢驗(yàn)

均勻性是標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)最基本的屬性, 是標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制能順利進(jìn)行的基礎(chǔ)。按照 JJG 1006-1994[20]和 JJF 1343-2012[21]中的相關(guān)規(guī)定, 從制得的200 袋樣品中隨機(jī)抽取15 袋, 進(jìn)行單元間均勻性檢測(cè), 每袋平行測(cè)定3 次,進(jìn)行單元內(nèi)均勻性檢測(cè)。樣品最小取樣量為2.0 g, 用超高液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè), 對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行單因素方差(F檢驗(yàn)法)分析, 評(píng)價(jià)樣品的均勻性。

1.5 穩(wěn)定性檢驗(yàn)

依據(jù)JJG 1006-1994[20]和JJF 1343-2012[21]的規(guī)定, 按照先密后疏的原則進(jìn)行樣品運(yùn)輸過(guò)程中的短期穩(wěn)定性考察和儲(chǔ)存過(guò)程中的長(zhǎng)期穩(wěn)定性考察。在44℃條件下, 于0、1、4、7、14 d 檢測(cè)樣品中的FB1 毒素含量, 考察樣品的短期穩(wěn)定性; 在4℃和?18℃條件下, 于0、1、2、4、6月分別檢測(cè)樣品的FB1 毒素含量, 考察樣品的長(zhǎng)期穩(wěn)定性。每次檢測(cè)隨機(jī)取3 袋標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品, 每一袋樣品平行測(cè)定2 次, 取2 次數(shù)據(jù)的平均值作為最終檢測(cè)結(jié)果。所用檢測(cè)方法與均勻性檢驗(yàn)保持一致。

對(duì)測(cè)定結(jié)果采用趨勢(shì)分析法進(jìn)行分析, 以此來(lái)考察線性關(guān)系的斜率隨樣品穩(wěn)定性變化的變化值, 用該變化值對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià),擬合直線Y=b0+b1X,X表示穩(wěn)定性考察時(shí)間,Y表示標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特性值,b0、b1表示回歸系數(shù), 若|b1|＜t0.95, n-2·s(b1), 說(shuō)明斜率無(wú)顯著性變化,該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在監(jiān)測(cè)時(shí)間內(nèi)能夠保持穩(wěn)定。該擬合直線的斜率計(jì)算公式為：

截距計(jì)算公式為：

直線標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算公式為：

斜率的不確定度計(jì)算公式為：

1.6 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值和不確定度

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值依據(jù)《標(biāo)準(zhǔn)樣品定值的一般原則和統(tǒng)計(jì)方法》[23]的要求, 本次標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值采取6～8 家實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合測(cè)定的方法, 所選定的實(shí)驗(yàn)室均為國(guó)內(nèi)權(quán)威檢測(cè)機(jī)構(gòu)且具有伏馬毒素檢測(cè)資質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室。各實(shí)驗(yàn)室均按照GB 5009.240-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中伏馬毒素的測(cè)定》進(jìn)行檢測(cè)。將各實(shí)驗(yàn)室的組間數(shù)據(jù)經(jīng)格拉布斯(Grubbs)檢驗(yàn)進(jìn)行可疑值剔除, 科克倫(Cochran)法檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室間數(shù)據(jù)是否為等精度數(shù)據(jù), 狄克遜(Dixon)法檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室間數(shù)據(jù)是否有離群值。計(jì)算出符合條件的實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)的平均值, 該平均值即為樣品的定值結(jié)果。

依據(jù)《不確定度評(píng)估指南》[24]和GB/T 15000.3-2008[25]的方法, 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不確定度主要由3 個(gè)方面組成, 即均勻性引起的不確定度ubb、穩(wěn)定性引起的不確定度us、定值過(guò)程中引入的不確定度uchar。其中穩(wěn)定性不確定度us包括短期穩(wěn)定性不確定度usts和長(zhǎng)期穩(wěn)定性不確定度uIts。

2 結(jié)果與分析

2.1 均勻性檢驗(yàn)結(jié)果

采用單因素方差分析法進(jìn)行與單元內(nèi)的均勻性檢驗(yàn),F為單元間方差與單元內(nèi)方差的比值, 與在95%置信水平下的臨界值Fα比較大小, 若F值小于Fα, 則認(rèn)為樣品間無(wú)顯著性的差異, 均勻性好。本文Fα為F0.05(14,30)= 2.04, 檢驗(yàn)結(jié)果由表1 可知,F＜F0.05(14,30), 說(shuō)明玉米粉中FB1 樣品均勻, 能滿足標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性要求。

2.2 穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果

表2 為玉米樣品在44℃環(huán)境下保存14 d 所測(cè)數(shù)據(jù),由表2 可知, 玉米樣品在14 d 內(nèi)所計(jì)算出|b1|＜t0.95,n-2·s(b1),且由圖1 所示, 直線擬合方程的斜率不顯著, 因此該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在44℃模擬運(yùn)輸環(huán)境下可以保持穩(wěn)定。

表1 玉米粉中伏馬毒素FB1 均勻性檢驗(yàn)結(jié)果Table 1 Test results of homogeneity of Fumzonisins FB1 in corn flour (μg kg-1)

表2 玉米粉中伏馬毒素FB1 短期穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果Table 2 Short-term stability test results of Fumonisins FB1 in corn flour (μg kg-1)

圖1 玉米粉中伏馬毒素FB1 短期穩(wěn)定性趨勢(shì)分析圖Fig. 1 Analysis chart of short-term stability trend of Fumonisins FB1 in corn flour

表3 為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在4℃和?18℃條件下儲(chǔ)存6 個(gè)月, 分別在1、2、4、6 個(gè)月時(shí)對(duì)樣品用UPLC-MS/MS 進(jìn)行伏馬毒素含量檢測(cè), 取樣方法、數(shù)據(jù)處理與短期穩(wěn)定性檢驗(yàn)一致, 由表3 可知, 該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在6 個(gè)月時(shí)間范圍內(nèi)|b1|＜t0.95,n-2·s(b1), 且由圖2 所示, 該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的擬合直線斜率不顯著, 即玉米粉中伏馬毒素FB1 含量無(wú)明顯增加或減少,因此可認(rèn)為該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在4℃、?18℃溫度下可以較好地儲(chǔ)存6 個(gè)月。

2.3 定值和不確定度分析

本批標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)由多家實(shí)驗(yàn)室采用指定檢測(cè)方法進(jìn)行聯(lián)合定值, 為每家實(shí)驗(yàn)室隨機(jī)分發(fā)兩袋樣品, 對(duì)每袋樣品至少平行測(cè)定3 次, 最終每家實(shí)驗(yàn)室提供6 組數(shù)據(jù)。將所有實(shí)驗(yàn)室所測(cè)數(shù)據(jù)匯總并分析, 每個(gè)實(shí)驗(yàn)室的組內(nèi)數(shù)據(jù)經(jīng)狄克遜準(zhǔn)則檢驗(yàn)是否有異常值, 各實(shí)驗(yàn)室的定值數(shù)據(jù)經(jīng)格拉布斯檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析, 采用科克倫準(zhǔn)則判斷數(shù)據(jù)有無(wú)可疑值, 最終有6 家實(shí)驗(yàn)室的數(shù)據(jù)被采用(表4), 將所保留的最終數(shù)據(jù)計(jì)算出平均值, 即為最終的定值結(jié)果。

表3 玉米粉中伏馬毒素FB1 長(zhǎng)期穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果Table 3 Long-term stability test results of Fumonisins FB1 in corn flour (μg kg-1)

圖2 玉米粉中伏馬毒素FB1 長(zhǎng)期穩(wěn)定性趨勢(shì)分析圖Fig. 2 Analysis chart of long-term stability trend of Fumonisins FB1 in corn flour

2.4 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不確定度

2.4.1 均勻性不確定度

2.4.2 穩(wěn)定性引入的不確定度

短期穩(wěn)定性不確定度usts=s(b1)·t=3.6429×14=51 μg kg-1

長(zhǎng)期穩(wěn)定性不確定度ults= 59.61 μg kg-1

2.4.3 定值引入的不確定度 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值過(guò)程中帶來(lái)的A 類不確定度, 主要為聯(lián)合定值過(guò)程中引入的不確定度, B 類不確定度主要為對(duì)測(cè)量產(chǎn)生影響的因素所產(chǎn)生的不確定度。

聯(lián)合定值引入的不確定度uA=10.05%

測(cè)量過(guò)程中不確定度uB=1.0%

2.4.4 擴(kuò)展不確定度

表4 各實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合定值測(cè)定結(jié)果Table 4 Results of joint determination of fixed value by various laboratories (μg kg-1)

3 討論

本研究通過(guò)對(duì)JJF 1343-2012《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的通用原則及統(tǒng)計(jì)學(xué)原理》[21]以及ISO 導(dǎo)則[22]的學(xué)習(xí)和研究, 制備了玉米粉中伏馬毒素FB1 基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì), 將購(gòu)買(mǎi)的玉米樣品經(jīng)篩選, 加伏馬毒素FB1 標(biāo)準(zhǔn)溶液浸泡, 冷凍干燥,磨粉, 混勻后抽真空包裝制得標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。按照 JJG 1006-1994[20]與JJF1343-2012[21]中的有關(guān)規(guī)定, 對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行均勻性檢驗(yàn)和為期半年的穩(wěn)定性檢驗(yàn)的研究。根據(jù)《標(biāo)準(zhǔn)樣品定值的一般原則和統(tǒng)計(jì)方法》[23]中的要求, 選取了多家具有伏馬毒素檢測(cè)資質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行定值, 因毒素檢測(cè)較為復(fù)雜, 且不同實(shí)驗(yàn)室操作環(huán)境及不同操作人員難以保證檢測(cè)結(jié)果在誤差范圍內(nèi), 最終只有6 家實(shí)驗(yàn)室結(jié)果予以采用, 最后計(jì)算平均值即為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值結(jié)果。

實(shí)驗(yàn)中對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中的伏馬毒素FB1 用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行了均勻性和穩(wěn)定性檢驗(yàn), 均勻性檢驗(yàn)F＜F0.05(14,30), 可以證明所研制的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)達(dá)到了均勻性的要求, 穩(wěn)定性檢驗(yàn)分為短期穩(wěn)定性和長(zhǎng)期穩(wěn)定性檢驗(yàn), 檢驗(yàn)結(jié)果在置信水平p=0.95% (95%置信水平)下, 檢驗(yàn)擬合直線斜率b1小于t0.95, n-2·s(b1), 斜率無(wú)顯著性差異,因此在6 個(gè)月時(shí)間范圍內(nèi), 伏馬毒素FB1 穩(wěn)定性良好, 符合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)要求。最后經(jīng)聯(lián)合定值得出該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特征值為1475.56 μg kg-1, 不確定度為169.98 μg kg-1。

因目前國(guó)內(nèi)對(duì)于生物毒素基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制較少,尤其基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)起步更晚, 基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制過(guò)程較為復(fù)雜, 但其與待檢測(cè)樣品有較高相似性, 能夠避免干擾檢測(cè)結(jié)果, 因此研制基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是很有必要的, 對(duì)于我國(guó)的生物毒素檢測(cè)技術(shù)的提升具有重要意義。