許 倩, 張 晨， 吳嘉維， 歐陽嘉

(南京林業(yè)大學 化學工程學院，江蘇 南京 210037)

花青素屬于水溶性色素，植物的葉子、果實和花朵中都有花青素的存在。植物界產(chǎn)生的花青素種類較少，已知的僅有20多種，但通過甲基化、糖基化以及與脂肪族和芳香族基團的酰基化可以實現(xiàn)花青素不同的特征，比如穩(wěn)定性、溶解性、生物利用度、抗氧化性等[1]。糖基化是最普遍的方法，花青素與一個或多個葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖等通過糖苷鍵形成花色素苷。天竺葵色素、矢車菊色素、翠雀素或飛燕草色素、芍藥色素、牽牛花色素和錦葵色素為植物中較常見的6種花青素[2-3]?；ㄇ嗨貜V泛存在于植物花瓣、果實的細胞液組織及莖葉的表面細胞中[4]。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)：在葡萄籽、藍莓、紫甘藍、山楂皮和茶葉等植物中均發(fā)現(xiàn)了花青素[5]。植物中的花青素不僅賦予了植物多彩的顏色，近年來的研究表明：花青素還具有多種生理功能，如抑制血小板凝固，預防血栓、心臟病，抗炎、抗癌等[5]。由于花青素具有抗菌、抗氧化、抗炎和抗誘變等特性，因此可以起到預防和治療許多慢性疾病的作用，如代謝紊亂、癌癥、眼病和心血管疾病等[6-9]。李泓燁[10]研究了紫甘薯花青素對慢、急性酒精性肝損傷，以及體外培養(yǎng)的人肝癌細胞SNU-387的影響，結果表明：紫甘薯花青素不僅可以降低谷草轉氨酶(AST)、谷丙轉氨酶(ALT)活力，使細胞腫脹消退，維持細胞結構，還可以參與介導肝癌細胞SNU-387的凋亡過程，通過抑制肝癌細胞中的超氧化物歧化酶(SOD)的活力來提高活性氧含量，從而促進癌細胞的凋亡。

由于花青素具有多種生理功能，同時可以預防和治療多種疾病，因此人們對于花青素研究的興趣也不斷增加。從植物中提取花青素是最方便的一種方法，雖然產(chǎn)物種類較多，但是資源浪費較大而且最終分離純化難度較大。隨著近幾年的深入研究，逐漸明確了花青素在植物中的合成途徑并確定了花青素合成的關鍵酶基因，并且對于提高花青素穩(wěn)定性及產(chǎn)量方面有較明顯的突破。因此，作者綜述了花青素的生物合成途徑及修飾方法，介紹了從植物中提取及微生物合成花青素的制備技術，分析了花青素合成的影響因素，從而更深入地了解花青素的研究現(xiàn)狀及在制備過程中的限制性因素，以期為花青素的制備及應用提供參考。

1 花青素的生物合成途徑

1.1 概述

花青素的生物合成途徑是植物次生代謝產(chǎn)物研究最廣泛的途徑之一。近20年來，大多數(shù)參與該生物合成途徑的酶和基因已經(jīng)被表征[11-12]。在植物中，花青素衍生自黃烷酮，例如柚皮素和圣草酚，它們本身衍生自苯丙烷途徑[13-14]。以圣草酚為例，其生物合成途徑主要包括3個步驟：從酪氨酸到對香豆酰輔酶A(CoA)的開始步驟、從對香豆酰CoA和丙二酰CoA到二氫槲皮素的早期步驟以及從二氫槲皮素到花色素苷的后期步驟[15]。常見的6種花青素的結構如圖1所示。

圖1 常見的6種花青素[3]Fig.1 Six kinds of common forms of anthocyanins[3]

由于柚皮素和圣草酚這2個前體物質(zhì)較為容易獲得，因此對應的天竺葵色素及矢車菊色素研究較多，而飛燕草色素的前體物質(zhì)合成量較少，雖有研究但是產(chǎn)量無法與前面2種花青素相比，而其他3種色素結構更加復雜，因此作者主要介紹了矢車菊色素、天竺葵色素和飛燕草色素的生物合成途徑。

1.2 矢車菊色素的合成

如圖2所示[16]，開始的步驟是從苯丙氨酸到肉桂酸，然后通過對香豆酸到對香豆酰CoA，分別由苯丙氨酸裂解酶(PAL)，肉桂酸- 4-羥化酶(C4H)和4-香豆酰輔酶A連接酶(4CL)催化[17]。在該過程中還產(chǎn)生羥基肉桂酸衍生物如單木質(zhì)醇和芥子酸酯，接下來由4-香豆酸3-羥化酶(Coum3H)將對香豆酰CoA變成咖啡酰CoA[18]。

之后是從咖啡酰CoA通過查爾酮和圣草酚到二氫槲皮素的步驟，它們分別由查爾酮合成酶(CHS)，查爾酮異構酶(CHI)和黃烷酮3-羥化酶(F3H)催化，黃烷酮在C3位置被黃烷酮3-羥化酶(F3H)羥基化，產(chǎn)生二氫槲皮素。若對香豆酰CoA沒有經(jīng)過羥基化，則會生成柚皮素(圖中未畫出)。除了通過4-香豆酸3-羥化酶(Coum3H)生成咖啡酰CoA外，Zhu等[15]報道了從酪氨酸到柚皮素的過程，該過程與上述途徑相同，不同的是在生成柚皮素后，通過類黃酮3′-羥化酶(F3′H)和細胞色素P450還原酶(CPR)作用下生成圣草酚(圖3)。

圖2 花青素合成途徑[16]Fig.2 Synthesis pathway of anthocyanins[16]

二氫黃酮醇4-還原酶(DFR)催化下一步驟，即C4位置的羰基還原，產(chǎn)生不穩(wěn)定的中間體無色花青素。之后通過花青素合成酶(ANS)在酸性條件下脫氫、異構化和脫水，將無色花青素催化形成花色素。通過二磷酸尿苷葡萄糖(UDP-葡萄糖)：類黃酮-3-O-葡糖基轉移酶(3GT)催化的C3-葡糖基化反應可以將不穩(wěn)定的花青素，形成一種相對穩(wěn)定的花青素-3-O-葡萄糖苷[19]。

1.3 天竺葵色素的合成

與矢車菊色素合成過程不同的是，天竺葵色素的合成過程較為簡單，前期步驟與圖3相同，在生成對香豆酰CoA后在CHS、CHI的作用下生成柚皮素。柚皮素在黃烷酮3-羥化酶(F3H)作用下生成二氫山奈酚，然后在二氫黃酮醇4-還原酶(DFR)和花青素合成酶(ANS)作用下生成天竺葵色素(見圖4)，最后經(jīng)過不同的糖基化修飾，生成相對穩(wěn)定的花色素苷。

圖3 從酪氨酸到圣草酚合成途徑[1]Fig.3 Synthesis pathway of eriodictyol from tyrosine[1]

圖4 天竺葵色素合成途徑[20]Fig.4 Synthesis pathway of geranium pigment[20]

Nakamura等[20]通過調(diào)節(jié)涉及在蝴蝶草中的類黃酮生物合成的基因表達，使得飛燕草色素的途徑被成功轉化為生成天竺葵素的途徑，并且實現(xiàn)了從藍色/紫色到粉紅色的顏色變化。通過將內(nèi)源類黃酮3-羥化酶(F3H)和類黃酮3,5-羥化酶(F35H)基因的下調(diào)與異源基因的表達組合，從藍色或紫色栽培品種獲得具有各種粉紅色花瓣色調(diào)的轉基因蝴蝶草，使用玫瑰的二氫黃酮醇4-還原酶(DFR)基因的額外表達提高了天竺葵色素的水平并產(chǎn)生了較暗的粉紅色花瓣。天竺葵色素DFR基因的表達代替玫瑰DFR基因，增加了天竺葵色素的水平并使花瓣顏色變暗。將含有DFR基因的兩個遺傳構建體引入紫羅蘭品種，其具有更多的花色素苷以及比藍色更深的顏色，進一步提高了天竺葵色素和粉紅色強度的水平。該研究表明：選擇合適的基因來源和宿主極大地影響了所得轉基因植物的表型。

1.4 飛燕草色素的合成

飛燕草色素合成途徑如圖5所示[21]，合成該色素既可以從柚皮素出發(fā)，也可以從二氫山奈酚出發(fā)，在類黃酮3′,5′-羥化酶(F3′5′H)作用下生成二氫楊梅素，最后生成飛燕草色素。與上述2種花青素相同，飛燕草色素的穩(wěn)定性較差，需要經(jīng)過進一步的修飾才能形成穩(wěn)定的產(chǎn)品。

花青素合成的遺傳學研究始于20世紀孟德爾關于豌豆花色的研究。從那時起，對許多不同物種的色素生產(chǎn)的遺傳學和生物化學進行了深入研究。經(jīng)過數(shù)十年的研究，逐漸摸索出植物中花青素合成的相關途徑并對相關基因進行了突變改造。在早期研究中發(fā)現(xiàn)，遺傳位點與易于觀察到的顏色變化相關。在確定花色素苷和其他類黃酮的結構后，可以將單個基因與花青素的特定結構改變或特定類黃酮的存在或不存在相關聯(lián)?；ㄇ嗨鼗虻耐蛔円驯谎芯慷嗄闧22]，因為它們易于鑒定，并且通常不會對植物生長和發(fā)育產(chǎn)生有害影響。在大多數(shù)情況下，在鑒定其功能或分離相應基因之前，分離并表征了影響花色素苷生物合成途徑的不同步驟的突變[23]。

圖5 飛燕草色素合成途徑[21]Fig.5 Synthesis pathway of delphinidin pigment[21]

2 花青素的修飾

合成花青素的不同物種經(jīng)過不同的修飾，可以形成不同的花青素，常見的修飾方法有糖基化、甲基化和?；?。

2.1 糖基化

花青素糖基轉移酶(UGT)決定糖基化的位置，對于植物花青素的穩(wěn)定性和可溶性起著重要的作用。通常，天然存在的花色素苷為具有一個或多個糖部分的糖基化形式。糖基化通常取代C-3，C-5，C-7，C-3′，C- 4′和C-5′位置的羥基，C-3位置最常被糖基化，其次是C-5[24]。與花青素連接的糖基(即葡萄糖、半乳糖、木糖、葡萄糖醛酸和阿拉伯糖)經(jīng)常會進一步糖基化或?；?，在油點草的C-8位置觀察到花青素C-糖基化是十分罕見的情況[24]。

花青素-O-糖基化是由糖基轉移酶(UGT)催化的，其使用類黃酮作為糖受體，UDP-糖作為糖類。UGT識別各種類黃酮糖苷配基的羥基，包括花青素?；ㄇ嗨氐慕Y構分析表明：UGT識別UDP-葡萄糖、UDP-半乳糖、UDP-鼠李糖、UDP-木糖、UDP-葡萄糖醛酸和UDP-阿拉伯糖[24]。

2.2 甲基化

甲基化修飾也在花青素改性中有過報道，大多數(shù)(90%)具有適當鑒定結構的花青素基于天竺葵色素、矢車菊色素、飛燕草色素、芍藥色素、矮牽牛花素和錦葵色素6種常見的花青素。甲基化的3種花青素(芍藥色素、矮牽?；ㄋ睾湾\葵色素)占報道的花青素的20%左右[25]。

S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)依賴性O-甲基轉移酶(OMT)用于催化許多天然植物化合物的甲基化。植物OMT分為兩類[26]：Ⅰ類OMT具有約23～27 ku的分子質(zhì)量并且需要二價離子如Mg2+才能具有活性，包括咖啡酰CoA 3-OMT；Ⅱ類包括Mg2+非依賴性OMT，分子質(zhì)量約為38～43 ku，由類黃酮OMT(黃酮醇3′-OMT、黃酮類7-OMT、異黃酮OMT和異甘草素2′-OMT)、咖啡酸3-OMT、兒茶酚OMT和肌醇OMT等組成。來源于矮牽牛、金魚草和玉米的OMT在花青素合成途徑中已有較為廣泛的研究，其中大部分關于花青素OMT(AOMT)的信息來自矮牽牛。AOMT主要位于胞質(zhì)溶膠中[27]，花青素3′-OMT和花色素苷3′，5′-OMT分別由基因Mt1/Mt2和Mf1/Mf2編碼。2種類型的AOMT的酶活性與An1和An2基因型相關[28-29]，首先使用來自2個遺傳系V26(An1)和W162(An1-)的cDNA作為探針，通過差異篩選從矮牽牛中分離編碼AOMT的cDNA[30]，還克隆了來自蝴蝶草和燈籠海棠的AOMT的cDNA。有趣的是，這3種花青素OMT屬于I類OMT家族，而不屬于II類家族，但類黃酮OMT屬于II類家族。牽?；ê秃莸腁OMTs催化飛燕草苷衍生物(飛燕草3-O-葡萄糖苷、飛燕草3-O-蘆丁苷和飛燕草3,5-O-二糖苷)的甲基化，以SAM為甲基供體合成矮牽?；ㄉ蘸湾\葵花色苷。然而，矮牽牛AOMT的主要OMT活性物質(zhì)是花色素苷3′-OMT，而蝴蝶草AOMT則是花色素苷3′，5′-OMT，但是在氨基酸水平上矮牽牛和蝴蝶草AOMT的序列同一性為56%，因此需要鑒定AOMT編碼基因和來自各種植物的其他產(chǎn)物的生物化學表征，以便更好地理解花色素苷的甲基化[24]。

2.3 ?；?/h3>

酰基化是植物次生代謝物(包括花青素)最常見的修飾方法之一，通過芳香族或脂肪族取代基?；ㄇ嗨氐亩鄻有源蟠笤黾?。?；ㄇ嗨氐姆枷阕艴；〈ǔ榱u基肉桂?；?，例如對香豆素基、咖啡基、呋喃基和芥子基；脂肪族?；〈ū；?、乙?；㈢牾；?、馬來酰基、草?；褪送榛?，其中丙二?；嬖谧顬閺V泛。對于具有酰基化葡萄糖基的花青素，在許多情況下，芳香族和脂肪族?；寂c葡萄糖基的6-位連接。在胡蘿卜和歐芹的細胞培養(yǎng)中顯示：花青素和其他類黃酮的?；梢詫⑦@些物質(zhì)更加高效地轉移至液泡中存儲起來，從而滿足植物暫時分離那些不支持代謝甚至抑制代謝的物質(zhì)的需要[31-32]。

沒有酰基化的花青素在中性或弱酸性條件下很不穩(wěn)定，容易脫色。通常，在相同的細胞條件下，酰化花青素的著色比非?；问礁€(wěn)定，特別是多個芳香?；男揎?即聚酰化)使花青素的著色高度穩(wěn)定。聚酰化著色的穩(wěn)定性來自于芳香族?；突ㄉ睾说姆肿觾?nèi)面對面堆積，聚?；乃{色和穩(wěn)定作用均取決于芳香族酰基的數(shù)量和位置。在7-和3′-位置具有芳香酰化糖基的花色素苷可以提供最穩(wěn)定的藍色花色[33]。脂肪?；粫隗w外或體內(nèi)改變花色素的吸收光譜[31]，但是脂肪族?；鰪娏嘶ㄉ剀罩姆€(wěn)定性[33]。除此以外，?；€賦予了植物細胞中儲存的花青素的生物化學和分解代謝穩(wěn)定性，這是因為酰基化可以防止微生物糖苷酶對花青素的降解，而其中大多數(shù)微生物不能作用于?；擒誟34]。

朱良玉等[35]分析研究了篤斯越橘花青素的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)光照、溫度、氧化劑和還原劑、金屬離子等因素都與花青素穩(wěn)定性密切相關，在相同時間和溫度條件下，酰化花青素的穩(wěn)定性高于未?；ㄇ嗨兀阴；ㄇ嗨氐哪蜔嵝?、耐光性和抗氧化能力也高于未酰化花青素。

3 花青素的制備技術

3.1 從植物中提取

花青素廣泛存在于蘋果、葡萄、玉米、藍莓和擬南芥等植物中，采用有機溶劑提取是常見的提取方法，考慮到食品的安全性，乙醇是使用較為廣泛的提取溶劑。Cacace等[36]使用乙醇從黑加侖中提取花色素苷，優(yōu)化了其產(chǎn)率并分析了其抗氧化活性，結果表明：在30 ℃的最佳溫度下，使用60%乙醇可以獲得較高的總酚含量，其抗氧化活性可達到90%左右，含花青素達到15 mg/g左右。

Lee等[37]使用過熱乙醇-水混合物對釀酒殘渣(葡萄皮)進行提取，研究發(fā)現(xiàn)提取物中富含花青素和其他多酚，可用作天然著色劑或用于營養(yǎng)保健目的；同時還測試了使用過熱酸化水作為萃取劑，但萃取效率較低。

王宏等[38]通過平衡吸附實驗、等溫吸附實驗及柱吸附實驗，研究了黑枸杞中花青素在AB-大孔樹脂中的吸附行為及吸附機理，結果表明：AB-8大孔樹脂對花青素的吸附可用Elovich動力學模型描述；花青素的等溫吸附焓變?yōu)檎登医^對值小于40 kJ/mol，吉布斯自由能變?yōu)樨撝担刈優(yōu)檎?，說明吸附過程為多層物理吸附，吸附可自發(fā)進行；在柱吸附分離純化過程中要減少流動相的流量和床層高度，增加花青素的質(zhì)量濃度。

Chandrasekhar等[39]開發(fā)了一種從紅甘藍中提取和純化花青素的方法，使用體積分數(shù)50%乙醇和酸化水的混合物可以獲得最大的花青素質(zhì)量濃度(390.6 mg/L)；為了得到純化的花青素，使用6種不同的吸附劑進行吸附，結果發(fā)現(xiàn)非離子丙烯酸酯吸附劑Amberlite XAD-7HP，顯示出最高的吸附量(0.84 g/L)和解吸率(92.85%)。由于糖是花青素降解的主要原因，而純化后的花青素中不含糖，因此，與粗花青素相比，純化后的花青素沒有觀察到褐變并且色度增加了27%。

王輝[40]研究了木棉花紅色素的提取條件和理化性質(zhì)，結果發(fā)現(xiàn)以體積比1 ∶1的0.1 mol/L鹽酸和50%乙醇在60 ℃恒溫浸取2 h時，提取效率較好；木棉花紅色素屬于花青素類色素，受pH值的影響較為明顯且在酸性條件下穩(wěn)定性較好，在無紫外光，但有光照的條件下色素會被降解，鹽溶劑對于花青素的顏色影響較為明顯。田喜強等[41]對黑米花青素進行提取，通過改變浸提時間、料液比、提取溫度，得到最佳工藝條件為乙醇-乙酸乙酯混合溶液(體積比1 ∶1)，提取時間90 min，提取溫度80 ℃，料液比1 ∶6 (g ∶ mL)，此條件下黑米花青素的吸光度值為3.761；溫度、光照及氧化劑對于花青素的破壞影響較大。

Blackhall等[42]從新鮮的櫻桃中提取花青素，確定了最佳的提取時間和溫度分別為90 min和37 ℃，使用100%酸化溶劑按液固比10 ∶1(mL ∶g)進行提取時，得到的花青素產(chǎn)率最高，為2.44 mg/g(以新鮮櫻桃質(zhì)量計)；超高效液相色譜-質(zhì)譜分析鑒定結果表明：提取物中有4種花青素，其中花青素-3-蕓香苷和芍藥苷-3-蕓香苷占95%以上，而花青素-3-葡萄糖苷和天竺葵素-3-蕓香糖苷不到5%。

雖然從植物中可以提取得到花青素，但是直接提取受到季節(jié)、地域和植物生長的限制，如果需要用于大規(guī)模生產(chǎn)還要考慮其他的獲取方式。

3.2 微生物合成

通過微生物合成的方式獲得花青素，不僅解決了從植物中提取的諸多限制，而且可以通過人為的方式獲得所需的產(chǎn)物。

Yan等[43]為了從無色黃烷酮(如柚皮素和圣草酚)中產(chǎn)生穩(wěn)定的糖基化花青素，構建了一個包含來自異源植物基因的四步代謝途徑：來自蘋果的黃烷酮3β-羥化酶(F3H)、紅掌的二氫黃酮醇4-還原酶(DFR)、南天竹的花青素合成酶(ANS)和矮牽牛的3-O-葡糖基轉移酶(3GT)，使用兩輪PCR，首先將4種 基因中的每一種置于trc啟動子和其自身細菌核糖體結合位點的控制下，然后依次克隆到載體pK184中。含有重組植物途徑的大腸桿菌細胞能夠攝取柚皮素或圣草酚，并將其轉化為相應的糖基化花色素苷，天竺葵素-3-O-葡萄糖苷或花青素3-O-葡萄糖苷(矢車菊色素-3-O-葡萄糖苷)。產(chǎn)生的花青素以低濃度存在：發(fā)酵液中的天竺葵素-3-O-葡萄糖苷質(zhì)量濃度為5.6 μg/L，花青素3-O-葡萄糖苷質(zhì)量濃度為6.0 μg/L，而檢測到的大多數(shù)代謝物對應于它們的二氫黃酮醇前體以及相應的黃酮醇，雖然之后添加了ANS所需要的輔因子(2-氧戊二酸、抗壞血酸鈉和硫酸亞鐵)[44]，但是之后的產(chǎn)量還是顯著降低。副產(chǎn)物黃酮醇的存在是由于ANS催化的替代反應產(chǎn)生的。這是植物特異性花青素首次從微生物中產(chǎn)生，為以后提高花青素產(chǎn)量奠定了基礎。

Yan等[45]利用重組大腸桿菌從柚皮素和圣草酚中生產(chǎn)出毫克級的2種花青素：天竺葵素-3-O-葡萄糖苷(0.98 mg/L)和花青素3-O-葡萄糖苷(2.07 mg/L)，并以更高的產(chǎn)率從其黃烷-3-醇，(+)-兒茶素前體生產(chǎn)氰基3-O-葡萄糖苷(16.1 mg/L)。由于花青素在不同pH值中的穩(wěn)定性不同，因此作者還優(yōu)化了培養(yǎng)基的pH值，從而增強宿主細胞中UDP-葡萄糖的均勻合成，最后從它們的前體黃烷-3-醇中獲得了78.9 mg/L的天竺葵素-3-O-葡萄糖苷和70.7 mg/L的花青素3-O-葡萄糖苷，而沒有補充細胞外UDP-葡萄糖。

由于二氫黃酮醇4-還原酶(DFR)是花青素合成途徑的關鍵酶之一，因此Leonard等[46]研究不同來源的DFR能夠穩(wěn)定合成花青素的活性，研究表明DFR是重組大腸桿菌中前體苯丙素轉化為無色花青素的控制步驟，同時各種重組DFR的生物化學研究已經(jīng)能夠全面闡明DFR的底物特異性，每個DFR物種可能需要獨特的條件才能達到最佳活性。

已經(jīng)有前期的工作證明能從宿主菌導入合成花青素，但是只有提高產(chǎn)量才能實現(xiàn)大規(guī)模的生產(chǎn)。Lim等[47]通過增強底物和前體的可用性，平衡基因表達水平，優(yōu)化培養(yǎng)和誘導參數(shù)，系統(tǒng)地提高矢車菊素-3-O-葡萄糖苷(C3G)產(chǎn)量。該研究中，作者首次展示了一種通過優(yōu)化發(fā)酵條件篩選花青素產(chǎn)生菌的微量平板法，通過優(yōu)化培養(yǎng)基和菌株，培養(yǎng)時間縮短了48 h但是產(chǎn)量得到了提高。為了進一步提高生物轉化效率，該研究還采用了更具組合性的工程方法，如直接將ANS和3GT組合成一個融合蛋白，并利用雙順反操縱子表達這兩種酶，建立了一個更有效的表達系統(tǒng)；另外通過過表達另一種大腸桿菌中內(nèi)源性磷酸葡萄糖變位酶來增加UDP-葡萄糖的細胞內(nèi)濃度，該酶由ycjU編碼。單獨過表達ycjU酶時C3G的產(chǎn)量優(yōu)于同時表達Pgm和GalU酶時的產(chǎn)量。最后，通過較高的初始底物濃度，以及底物和葡萄糖濃度來改善培養(yǎng)條件，最終獲得350 mg/L的C3G產(chǎn)量。

Solopova等[48]使用乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)作為新型宿主，以綠茶為底物生產(chǎn)具有高價值的花青素，結果表明除了預期的紅紫色化合物——矢車菊色素和飛燕草色素外，由乳酸乳球菌以綠茶為底物產(chǎn)生了具有甲基化的橙色和黃色吡喃花青素。該研究表明工程化的乳酸乳球菌可以在16 h內(nèi)快速將綠茶中黃酮類成分轉化為一系列具有潛在應用價值的花青素衍生物。在乳酸乳球菌培養(yǎng)物中發(fā)現(xiàn)了2種 花青素和4種甲基吡喃花青素，雖然色素總產(chǎn)量(1.5 mg/L)不如工程化大腸桿菌菌株高(350 mg/L)，但是乳酸乳球菌能在較低的pH值和高黃酮濃度條件下比較穩(wěn)定地生產(chǎn)花青素，這具有比較明顯的優(yōu)勢，為利用其他富含黃烷-3-醇的原料生產(chǎn)有益健康的色素提供了可能。

Cress等[49]將幾種植物來源的花色素苷O-甲基轉移酶(AOMT)在大腸桿菌中與矮牽牛的花青素合成酶(PhANS)和擬南芥的花青素3-O-葡糖基轉移酶(At3GT)共同表達，其中來源于釀酒葡萄(VvAOMT1)和仙客來(CkmAOMT2)的AOMT對于生產(chǎn)芍藥3-O-葡萄糖苷(P3G)的3′-O-甲基化產(chǎn)物的效果較好，最高產(chǎn)量分別達到2.4和2.7 mg/L，之后進行過表達和使用CRISPRi沉默轉錄抑制因子MetJ，解除了對甲硫氨酸生物合成途徑的調(diào)控，最終獲得了51 mg/L甲基化的芍藥3-O-葡萄糖苷，按比例擴大培養(yǎng)后產(chǎn)量增加至56 mg/L，與對照組相比產(chǎn)量提升了2倍，這對于今后優(yōu)化花青素糖苷的甲基化生產(chǎn)具有指導意義。

4 影響花青素合成的因素

植物激素可以調(diào)節(jié)植物生長，雖然在植物中激素的含量較低，但是可以調(diào)節(jié)植物生長的許多方面，因此植物激素對于植物中花青素的產(chǎn)生也有影響。

湯睿等[50]利用外源尿黑酸處理擬南芥Col- 0幼苗(CK)，研究外源尿黑酸對花青素生物合成的影響。結果表明：外源尿黑酸能誘導擬南芥幼苗花青素的積累，通過熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)尿黑酸能促進花青素生物合成基因的表達且在突變體中基因表達上調(diào)明顯。

脫落酸(ABA) 是參與應激反應的植物激素，特別是對水脅迫的響應，因為ABA水平通常隨著水分脅迫引起的生長限制而增加。此外，ABA還可以增加植物器官中的干物質(zhì)積累，這是由于水分脅迫造成的組織減輕。Hiratsuka等[51]向葡萄細胞懸浮培養(yǎng)物中添加ABA，結果表明ABA可以極大地促進花青素的產(chǎn)生和CHI的活性，而CHI是花青素生物合成類黃酮途徑中的關鍵酶。Quiroga等[52]研究發(fā)現(xiàn)ABA噴霧可以顯著提高花青素的產(chǎn)量，而不會對收獲的葡萄質(zhì)量產(chǎn)生負面影響。還有研究表明[53-54]ABA不僅增加了葡萄皮中的花青素含量，還增加了花青素生物合成途徑中CHS、CHI、DFR和Ufgt基因的表達。

乙烯作為植物激素，可以調(diào)節(jié)果實成熟的許多方面。釋放乙烯的化合物2-氯乙基膦酸(2-CEPA)的應用可以加速葡萄皮中花青素的積累。El-Kereamy等[55]研究發(fā)現(xiàn)用2-CEPA處理葡萄漿果刺激了CHS、F3H、ANS和Ufgt(但不是DFR)基因的長期表達以及相關的花青素合成。

茉莉酸(JA)衍生自亞麻酸，是茉莉酮酸類植物激素的成員。JA及其類似物茉莉酸甲酯(MeJA)通常由植物產(chǎn)生，以響應許多生物和非生物脅迫。據(jù)報道，JA在用光照射的葡萄細胞懸浮培養(yǎng)物上的應用增加了花青素的產(chǎn)生[56]。除此以外，將MeJA與碳水化合物結合應用于葡萄細胞懸浮培養(yǎng)物，可刺激CHS和Ufgt的基因表達，從而使得花青素生物合成增強[57]。

其他植物激素如水楊酸，可以誘導葡萄漿果中編碼苯丙氨酸解氨酶(PAL)基因的表達，這是苯丙烷代謝的關鍵酶，可以催化反式肉桂酸的形成。因此，水楊酸可以間接刺激花青素的生物合成[58]。

Azuma等[59]提出溫度和光照是影響黃酮類化合物生物合成的重要環(huán)境因素，以葡萄為例，在低溫(15 ℃)和光處理條件下可以觀察到葡萄皮中有充足的花青素積累，而高溫(35 ℃)或暗處理則嚴重抑制花青素積累，表明花青素的積累依賴于低溫和光照。

5 結語與展望

花青素作為一種分布廣、種類多、安全性高和無毒性的黃酮類物質(zhì)，除了可以作為色素使用外，還是一種良好的抗氧化劑，在保健品中有較大的療效?；ㄉ剀站哂锌寡趸?、抗突變等性能，廣泛用于醫(yī)藥、化妝、食品等行業(yè)。從植物中直接提取花青素的方法較簡單，但是產(chǎn)量較低、產(chǎn)物多為花青素混合物而且受到季節(jié)、區(qū)域等限制。使用微生物合成的方法基于基因工程的手段可以實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)，減少花青素合成的限制；通過使用基因工程手段增加花青素在體外的穩(wěn)定性，還能實現(xiàn)花青素產(chǎn)物的多樣性。目前，雖然通過研究已經(jīng)明確了花青素合成的基本代謝途徑，但是該代謝途徑非常復雜，中間涉及到許多其他的次生代謝，因此仍需進一步的研究。除了需要避免產(chǎn)生其他副產(chǎn)物外，反應體系中UDP-葡萄糖的循環(huán)對于大量制備花青素糖苷具有較大的影響，這也是今后的重點研究方向?；ㄇ嗨刈鳛槠涮擒招问降那绑w對于pH值的敏感性較高，若在糖基化修飾前在反應體系中已被降解，這將會造成花青素糖苷產(chǎn)量的下降。花青素糖苷的形成是甲基化及其他更加復雜結構修飾的前提，因此探究能夠更好地穩(wěn)定花青素及花青素糖苷的方法，并且提高生物合成產(chǎn)量是進行更加復雜結構修飾的基礎。