柏中喜 方興剛 喬昱音 王夢(mèng) 崔林

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(PMOP)是絕經(jīng)后女性雌激素水平急劇下降而引起的最突出的慢性疾病之一[1]。因此，由于骨吸收增加，骨形成減少，導(dǎo)致骨重構(gòu)失衡。在與年齡相關(guān)的骨形成損傷的機(jī)制方面，生長(zhǎng)激素(GH)/胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)系統(tǒng)的缺乏癥(GH)和IGF系統(tǒng)的缺失已被認(rèn)為是一個(gè)重要的機(jī)制[2]。雖然許多動(dòng)物和臨床研究為IGF系統(tǒng)中的組分的潛在應(yīng)用增加骨量提供了實(shí)驗(yàn)證據(jù)，但由于我們對(duì)IGF系統(tǒng)中組分的生產(chǎn)和作用的調(diào)節(jié)認(rèn)識(shí)不全，這些成分在治療骨質(zhì)疏松癥中的臨床應(yīng)用尚未取得成果[3]。長(zhǎng)期以來(lái)，針灸一直與人體內(nèi)的穩(wěn)態(tài)(陰陽(yáng))調(diào)節(jié)有關(guān)，并具有促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)釋放神經(jīng)肽、激發(fā)深遠(yuǎn)的生理效應(yīng)，甚至激活自我愈合機(jī)制等作用。在臨床上，針灸被廣泛應(yīng)用于治療PMOP所致疼痛，是一種有用的替代和補(bǔ)充療法。針刺能改善骨礦含量(BMC)、骨密度(BMD)及與PMOP相關(guān)的各項(xiàng)指標(biāo)[4]。本研究采用動(dòng)態(tài)過(guò)濾雙能X線骨密度儀(DFDE-X)觀察BMC和BMD，并測(cè)定血清雌二醇(E2)、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)、胰島素樣生長(zhǎng)因子-BP1(IGF-BP1)和胰島素樣生長(zhǎng)因子-β3(IGF-BP3)水平，為臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 從復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)買85只12月齡雌性Sprague-Dawley大鼠(200～220 g)，發(fā)情周期為4 d。將動(dòng)物飼養(yǎng)在12/12(光/暗)的溫度控制(22.0±1.0)℃和12/12(光/暗)的條件下，每組飼養(yǎng)1次。大鼠隨機(jī)分為5組：完整組(INT組，n=16)，假手術(shù)組(Sham組，n=18)，模型組(Model組，n=18)，雌激素組(E組，n=16)，經(jīng)皮神經(jīng)電刺激組(EA組，n=17)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 卵巢切除在乙醚麻醉 (吸入麻醉，中國(guó)醫(yī)學(xué)和化學(xué)公司)下進(jìn)行。(中國(guó))模型大鼠，E組和EA組。在假動(dòng)物中，只有卵巢周圍的脂肪在相同的麻醉下被切除。所有大鼠行陰道涂片每日脫落上皮檢查，連續(xù)2個(gè)發(fā)情周期(8～9 d)。INT和SHAM顯示正常的4 d發(fā)情周期，而去卵巢大鼠陰道涂片脫落上皮細(xì)胞無(wú)明顯變化。大鼠在相同條件下飼養(yǎng)16周。實(shí)驗(yàn)程序均嚴(yán)格按照復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院的指導(dǎo)方針進(jìn)行。

1.3 口服與經(jīng)皮神經(jīng)電刺激治療 尼爾雌醇(北京四環(huán)制藥廠，1 mg/片)溶于蒸餾水(0.01 mg/ml)。E組大鼠口服尼爾雌醇0.9 ml/周/100 g(體重)，這是一種轉(zhuǎn)化劑量。用雙側(cè)“宣中穴(GB 39)”和“明門穴(DU 4)”于上午8∶00～12∶00，Q.D左右給EA組大鼠30 min，4周。針頭直徑0.22 mm，長(zhǎng)度10 mm，插入壓力標(biāo)準(zhǔn)。選穴原則遵循“實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)大鼠標(biāo)準(zhǔn)”。玄中(GB39)位于后肢外側(cè)，比外踝頂高約5 mm。明門(DU 4)位于第二腰椎的下方。針頭用橡膠水泥固定在穴位上。G 6805-Ⅱ型治療性刺激器的電脈沖頻率為2 Hz(120 r/min)，強(qiáng)度為1 mA，可產(chǎn)生輕微的肢體抽搐。所有大鼠均清醒，只被研究人員用手輕輕固定。大鼠在治療過(guò)程中沒有表現(xiàn)出任何疼痛或不適。在上一次實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，用DFDE-X骨密度儀在麻醉下掃描動(dòng)物，然后處死，提取血清。

1.4 BMC、BMD的測(cè)定 BMC和BMD用DFDE-X骨密度儀(NorlandXR-36美國(guó))在麻醉下對(duì)小動(dòng)物進(jìn)行測(cè)量。掃描參數(shù)為1.0 mm×1.0 mm，60 mm/s，12.00 cm，REV.3.9.3/2.1.0。腰部脊柱采用箱形法，右側(cè)大腿采用隨機(jī)法進(jìn)行分析。計(jì)算腰椎1～6椎體和右股骨的平均值。

1.5 RIA和ELISA法測(cè)定血雌激素和IGFS濃度 在處死時(shí)，與相應(yīng)的完整對(duì)照動(dòng)物一起，在發(fā)情期間收集血樣(1 ml)。血漿經(jīng)離心分離后，保存在-70℃冰箱中，待測(cè)定。血雌激素的濃度采用從國(guó)家原子能研究所(北京，中國(guó))購(gòu)買的雙抗體里亞試劑盒測(cè)定。樣品一式兩份，所有樣品一起測(cè)定。該試劑盒的靈敏度為2 pg/ml，批內(nèi)、批間變異系數(shù)為4.74%～7.7%。通過(guò)ELISA(Diagnostic Systems Laboratories，DSL，USA)檢查IGF-1，IGF-BP1和IGF-BP3。該試劑盒對(duì)IGF-Ⅰ、IGF-BP 1和IGF-BP3的靈敏度分別為30 ng/ml、0.25 ng/ml和0.04 ng/ml。所有程序都嚴(yán)格按照復(fù)旦大學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)和要求進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 腰椎1～6和右股骨的BMC和BMD比較 摘除卵巢后12周，隨機(jī)抽取大鼠進(jìn)行BMC和BMD檢測(cè)，以判斷模型的成功與否。此后，用雌激素或EA治療4周后，在DFDE-X骨礦物質(zhì)密度儀器下檢查所有大鼠。Model組大鼠腰椎1～6和右股骨的BMC和BMD明顯低于INT組和Sham組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。雌激素使右股骨的BMC和BMD略有增加，而EA則使腰部1～6的BMC和BMD有增加的趨勢(shì)。見表1。

2.2 5組大鼠IGF-1、IGF-BP1、IGF-BP3水平比較 Model組IGF-1和IGF-BP1水平明顯低于INT組和SHAM組(P<0.05)。E組和EA組IGF-1水平提高，EA組IGF-BP1的含量提高(P<0.05)。不同組間IGF-BP3差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

組別BMC腰椎1～6右股骨BMD腰椎1～6右股骨INT組(n=16)0.582±0.0210.433±0.0650.159±0.0250.157±0.022Sham組(n=18)0.554±0.0190.427±0.0570.147±0.0320.150±0.021Model組(n=18)0.463±0.078*0.307±0.066**0.119±0.038**0.124±0.020**E組(n=16)0.526±0.0520.363±0.029*#0.127±0.051*#0.132±0.019*#EA組(n=17)0.522±0.0320.298±0.060*#0.127±0.019*#0.130±0.025*

注：與INR組比較，*P<0.05；與Model組比較，#P<0.05

組別IGF-1IGF-BP1IGF-BP3INT組(n=16)4 260.65±378.9835.26±8.9719.43±3.23Sham組(n=18)3 766.90±91.8835.78±5.9519.80±0.97Model組(n=18)2 881.67±520.56*15.79±5.66*18.28±2.82E組(n=16)4 078.60±478.72#24.05±9.2317.90±0.48EA組(n=17)4 401.13±724.52#35.78±11.37#17.53±0.64

注：與INR組比較，*P<0.05；與Model組比較，#P<0.05

2.3 5組大鼠血清E2水平比較 與INT組比較，Model組和EA組血清E2水平顯著降低(P<0.01)，而Sham組和EA組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。E組E2水平高于Model組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表3。

組別E2INT組(n=16)110.02±11.54Sham組(n=18)91.87±20.30Model組(n=18)46.98±11.04*E組(n=16)98.00±11.02#EA組(n=17)41.20±18.22*

注：與INR組比較，*P<0.05；與Model組比較，#P<0.05

2.4 5組大鼠骨生物力學(xué)特性比較 與Sham組比較，Model組的骨最大載荷以及骨斷裂載荷的值均顯著降低(P<0.01)。與Model組比較，EA組、E組的骨最大載荷量以及骨斷裂載荷的值均有顯著性升高(P<0.01)。見表4。

組別骨最大載荷骨斷裂載荷INT組(n=16)114.87±4.02104.74±5.60Sham組(n=18)121.47±3.20*120.76±3.74*Model組(n=18)79.20±5.1760.11±5.47E組(n=16)117.54±3.57#102.30±3.98#EA組(n=17)108.13±4.27#87.62±5.47#

注：與INT組比較，*P<0.05；與Model組比較，#P<0.05

2.5 5組大鼠不同骨參數(shù)比較 與Sham組相比，E組的卵巢切除術(shù)降低了最大功率和剛度(P<0.05)。經(jīng)皮神經(jīng)電刺激可以逆轉(zhuǎn)這些降低(P<0.05)，但不一定是非穴位(P<0.05)。與Sham組相比，E組的BMD顯著降低(P<0.05)。INT組的經(jīng)皮神經(jīng)電刺激顯著增加BMD。然而，Model組沒有表現(xiàn)出顯著變化(P>0.05)。見表5。

3 討論

PMOP是一種以低骨量和骨組織微結(jié)構(gòu)惡化為特征的疾病，導(dǎo)致骨脆性增加，隨之而來(lái)的骨折風(fēng)險(xiǎn)增加。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，但普遍認(rèn)為骨吸收率大于骨形成率，從而導(dǎo)致凈骨丟失。早期識(shí)別有骨折風(fēng)險(xiǎn)的絕經(jīng)后女性，然后進(jìn)行有效的治療干預(yù)，可以極大改善患者的預(yù)后。有效的藥物治療已經(jīng)證明減少了椎體和非脊椎骨折的風(fēng)險(xiǎn)[5]。一些療法，如選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑和雙膦酸鹽，能夠在治療過(guò)程中盡早起作用，以降低椎體和非椎骨骨折的風(fēng)險(xiǎn)[6]。然而，由女性健康倡議(WHI)進(jìn)行的最大一次激素替代療法(HRT)隨機(jī)臨床試驗(yàn)的結(jié)果表明，長(zhǎng)期使用雌激素和孕激素HRT(EPRT)可以增加癌癥風(fēng)險(xiǎn)，甚至可能增加心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)，流行病學(xué)研究證實(shí)了HRT與女性生殖器官癌風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系?，F(xiàn)有證據(jù)表明，HRT使用者患乳腺癌或子宮內(nèi)膜癌的風(fēng)險(xiǎn)增加，且風(fēng)險(xiǎn)隨著使用時(shí)間的延長(zhǎng)而增加[7]。此外，由于診斷不足和骨質(zhì)疏松治療引起的疼痛，患者常尋求針刺治療。針灸也被認(rèn)為是預(yù)防骨質(zhì)流失的一種方法。據(jù)報(bào)道采用經(jīng)皮神經(jīng)電刺激配合耳穴治療女性骨質(zhì)疏松癥?；颊呓?jīng)過(guò)9次治療后完全康復(fù)，7個(gè)月后BMD明顯增加[8]。有研究者采用了對(duì)百會(huì)(GV20)，大椎(GV14)，志陽(yáng)(GV9)，明門(GV4)等經(jīng)絡(luò)的取消。分別從關(guān)元穴(CV4)、氣海穴(CV6)、腎舒穴(BL 23)、脾舒穴(BL 20)、宣中穴(BB 39)、太溪穴(KI3)、足三里穴(ST 36)、三陰交穴(SP6)、柴胡穴(BL32)中選取四、六穴，在“德氣”后留針40 min，1次/d[9]。同時(shí)，用艾灸2～3穴，持續(xù)15 min。治療前及治療后3個(gè)月，測(cè)量尺骨、橈骨、椎骨及骨盆的骨密度。結(jié)果表明，針灸治療骨質(zhì)疏松癥是一種有效的藥物治療的替代和補(bǔ)充療法，是更積極主動(dòng)治療骨質(zhì)疏松癥的一部分[10]。

組別最大功率(N)剛性(N/mm)INT組32.16±2.8958.51±2.26Sham組20.66±4.07*45.76±3.11*Model組30.27±4.0155.32±2.69E組28.31±5.12#54.11±3.98#EA組23.67±4.2447.96±5.21

注：與INT組比較，*P<0.05；與Model組比較，#P<0.05

IGF-1在BMD中起著重要作用。近年來(lái)，人類IGF-1基因P1啟動(dòng)子區(qū)上游多態(tài)性與不同民族人群血清IGF-1水平、BMD及骨折危險(xiǎn)性有關(guān)[11]。基因工程導(dǎo)致IGF-1缺乏小鼠和具有靶向過(guò)度表達(dá)IGF-1的小鼠強(qiáng)化了IGF-1在胚胎和出生后階段骨發(fā)育中的重要作用。對(duì)骨內(nèi)IGF調(diào)控系統(tǒng)及其信號(hào)通路的分子解剖，為骨質(zhì)疏松癥的治療提供了新的治療靶點(diǎn)[12]。

在6種IGF-1結(jié)合蛋白中，IGF-BP1和IGF-BP3對(duì)IGF-1的大部分生物活性起調(diào)節(jié)作用[13]。有證據(jù)也顯示了IBF BPs的重要調(diào)控作用，包括增強(qiáng)和抑制IBF效應(yīng)。IGF-BP3與90%以上的循環(huán)IGF-1結(jié)合，結(jié)合一個(gè)不穩(wěn)定的酸性亞基，形成穩(wěn)定的高分子量三元復(fù)合物(150 kDa)，延長(zhǎng)IGF-1的半衰期，防止IGF-1越過(guò)毛細(xì)血管壁[14]。IGF-1還與其他BPs，主要是IGF-BP1(30～40 kDa)形成較小的二元配合物，可穿過(guò)毛細(xì)血管，從而促進(jìn)IGF-1向靶組織的轉(zhuǎn)運(yùn)。在我們的研究中，EA可能增加IGF-1和IGF-BP1，促進(jìn)IGF-1和IGF-BP1與PMOP的結(jié)合，而雌激素主要影響E2和雌激素受體(ERs)。雌激素不僅對(duì)生殖組織功能很重要，而且還影響包括骨和心血管組織在內(nèi)的外周組織[15]。雌激素對(duì)幼齡和老年動(dòng)物骨密度的保護(hù)作用是公認(rèn)的[16]。因此，與雌激素相比，經(jīng)皮神經(jīng)電刺激可能具有抑制PMOP的獨(dú)特機(jī)制。

針灸長(zhǎng)期以來(lái)一直與體內(nèi)平衡(陰陽(yáng))調(diào)節(jié)相聯(lián)系，而針灸療法在今天的生殖和代謝醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用，在過(guò)去的10年里已經(jīng)在西方建立起來(lái)，這是通過(guò)堅(jiān)實(shí)的科學(xué)數(shù)據(jù)來(lái)支持的[17]。我們觀察到經(jīng)皮神經(jīng)電刺激可顯著提高去卵巢大鼠的血E2水平。然而，在本研究中，我們沒有發(fā)現(xiàn)EA對(duì)PMOP大鼠e2的影響，這可能是因?yàn)?2個(gè)月的雌性大鼠被使用并經(jīng)歷了去卵巢手術(shù)。此外，經(jīng)皮神經(jīng)電刺激可能通過(guò)IGF系統(tǒng)而不是雌激素來(lái)增加PMOP大鼠的骨密度，這也解釋了為什么EA出現(xiàn)較少的不良反應(yīng)和癌癥風(fēng)險(xiǎn)。

經(jīng)皮神經(jīng)電刺激還能提高機(jī)體的免疫功能和代謝功能。白介素-6、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β、骨形態(tài)發(fā)生蛋白等可能參與了經(jīng)皮神經(jīng)電刺激對(duì)胰島素樣生長(zhǎng)因子系統(tǒng)的影響[18]。然而，所有這些推測(cè)都需要在進(jìn)一步的研究中得到證實(shí)。

綜上所述，經(jīng)皮神經(jīng)電刺激可增加PMOP大鼠骨密度，增加IGF-1和IGF-BP1的含量，其作用途徑與雌激素不同。