蔡莉，王甫群

（1.江陰職業(yè)技術(shù)學(xué)院環(huán)境與材料工程系，江蘇江陰214405；2.無錫佰翱得生物科學(xué)有限公司，江蘇江陰214431）

His-prescssion 蛋白酶是一種帶有便于分離純化的His 標(biāo)簽的蛋白酶，其上的His 標(biāo)簽將會在最后純化分離中除去，留下的就是PreScission 蛋白酶。PreScission蛋白酶是一種遺傳改造的融合蛋白，由人鼻病毒3C 蛋白酶（HCV3C）和GST 組成[1]。這種蛋白酶是專為蛋白酶的去除而設(shè)計(jì)，能同時(shí)實(shí)現(xiàn)蛋白酶的固定和pGEX-6P 載體（pGEX-6P-1、pGEX-6P-2 和 pGEX-6P-3）所產(chǎn)生的GST 融合蛋白的切割[2]。PreScission 蛋白酶能特異切割Glu和Gly殘基之間的識別序列Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro，在4℃左右酶活最高，所以酶切在4℃左右時(shí)進(jìn)行，既可以保持目的蛋白的穩(wěn)定性，又能達(dá)到最佳酶切效果。在5℃，50 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM DTT（pH 7.0）的反應(yīng)體系中，一個(gè)單位酶 16 h 可切割 100 μg 待測 GST 標(biāo)簽蛋白，切割效率在90%以上[3]。

PreScission 蛋白酶作為在蛋白分離純化過程中應(yīng)用在親和純化時(shí)的酶切用酶，在生物醫(yī)藥領(lǐng)域具有很高的應(yīng)用價(jià)值，其應(yīng)用廣泛，具有很高的生物科研價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，如上海七海復(fù)泰生物科技有限公司生產(chǎn)的PreScission Protease100U 市場售價(jià)為750 元，進(jìn)口的則更加昂貴。隨著現(xiàn)代生物科技的不斷發(fā)展與壯大，Pre?Scission 蛋白酶的應(yīng)用范圍與應(yīng)用價(jià)值也會提高，其經(jīng)濟(jì)價(jià)值不可小覷。

1 材料與方法

1.1菌種

大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，BL21(DE3)-T1R，北京天根生化科技有限公司；Rosetta2(DE3)、Origami2(DE3)，上海拜力生物科技有限公司。

1.2 試劑及儀器

核酸蛋白測定儀，賽默飛世爾科技公司；雙穩(wěn)定電泳儀，北京六一儀器廠；干浴微量恒溫器、脫色搖床，其林貝爾儀器制造有限公司；紫外分光光度計(jì)，上海優(yōu)尼柯有限公司；雙層試管搖床，上海智城分析儀器制造有限公司；生物潔凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.3質(zhì)粒的提取及菌種的轉(zhuǎn)化

①含His-prescisssion 基因的質(zhì)粒的菌種復(fù)壯；②含His-prescisssion 基因的質(zhì)粒的提?。虎鄞竽c桿菌菌種的轉(zhuǎn)化。

1.4 His-prescission蛋白酶的表達(dá)及流程

（1）His-prescission蛋白酶的表達(dá)

本蛋白來源為大腸桿菌，屬于初級代謝產(chǎn)物，大腸桿菌與本蛋白酶的生產(chǎn)關(guān)系為生產(chǎn)產(chǎn)物偶聯(lián)型。該目的蛋白在表達(dá)過程中，在不加誘導(dǎo)劑前，可少量表達(dá)或不表達(dá)，加入適量的誘導(dǎo)劑后可大量表達(dá)。在37℃誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)，可形成大量包涵體，在分離純化過程可經(jīng)復(fù)性加工使其恢復(fù)生物活性。

（2）His-prescission酶的表達(dá)流程（圖1）

圖1 His-prescission酶的表達(dá)流程圖

1.5 分析方法

生物量的測定：取1 mL 發(fā)酵培養(yǎng)液至比色皿中，用紫外可見分光光度計(jì)于600 nm（OD600 nm）處測定吸光值。

發(fā)酵液中目的蛋白的測定：取1 mL 發(fā)酵培養(yǎng)液至比色皿中，用紫外可見分光光度計(jì)于600 nm（OD600 nm）處測定吸光值。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)公式：取樣量=0.5/吸光值。將取好的樣按SDS-PAGE 電泳的操作步驟完成蛋白樣的制備及SDS-PAGE 電泳，看聚丙烯酰胺凝膠電泳圖，根據(jù)目的蛋白條帶的顏色深淺和條帶的面積大小，判斷目的蛋白的表達(dá)結(jié)果。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

（1）小劑量表達(dá)

在本試驗(yàn)中，分別選取BL21（DE3）-TIR、Rosetta2(DE3)、Origami2(DE3)三種感受態(tài)細(xì)胞作為重組基因His-prescission 的宿主菌，探討重組基因在這3 種感受態(tài)的表達(dá)效果。

圖2 轉(zhuǎn)化BL21(DE3)和Rosetta2(DE3)、Origami2(DE3)蛋白表達(dá)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析：His-prescission 蛋白酶的條帶位置在 17.5 kDa 處，由圖 2 轉(zhuǎn)化 BL21(DE3)和 Rosetta2(DE3)、Origami2(DE3)蛋白表達(dá)結(jié)果可看出，以BL21(DE3)-T1R作為宿主菌，目的蛋白表達(dá)量最大，所以感受態(tài)BL21(DE3)-T1R 為表達(dá)His-prescission 蛋白酶的最佳宿主菌。感受態(tài)細(xì)胞Rosetta2(DE3)表達(dá)His-prescission 蛋白酶的表達(dá)量次之。感受態(tài)細(xì)胞Origami2(DE3)表達(dá)Hisprescission蛋白酶最少。

（2）大劑量表達(dá)

在9 個(gè)3 L 的大搖瓶上寫好標(biāo)簽，每個(gè)搖瓶內(nèi)加入600 μL 的 Kana 抗生素，將 20 mL 菌種加到 1 200 mL LB液體培養(yǎng)基內(nèi)，使用橡皮筋扎緊封口膜，分別放入三個(gè)搖床培養(yǎng)，待生物量長至相應(yīng)的誘導(dǎo)時(shí)機(jī)時(shí)，加入IPTG 誘導(dǎo)培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后取200 μL的菌液稀釋5倍后在600 nm下測OD值，取樣跑SDS-PAGE[4-6]。

圖3 正交試驗(yàn)蛋白表達(dá)結(jié)果

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析表1，得出結(jié)論：

（1）當(dāng)培養(yǎng)條件為搖瓶裝液量為1 200 mL，接種量為20 mL，培養(yǎng)溫度為37℃，搖床轉(zhuǎn)速為130 rpm，誘導(dǎo)時(shí)機(jī)為1.0時(shí)加入IPTG 0.1 mM，誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h后，培養(yǎng)基中菌體濃度最高。

（2）當(dāng)培養(yǎng)條件為搖瓶裝液量為1 200 mL，接種量為20 mL，培養(yǎng)溫度為37℃，搖床轉(zhuǎn)速為130 rpm，誘導(dǎo)時(shí)機(jī)為0.7時(shí)加入IPTG 0.1 mM，誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h后，單位菌體內(nèi)蛋白表達(dá)量最高。

（3）由此可以看到以兩種結(jié)果分析得到誘導(dǎo)時(shí)機(jī)不同，所以將上述正交實(shí)驗(yàn)的生物量和蛋白表達(dá)量作了對比，如圖4所示。

圖4 正交實(shí)驗(yàn)的生物量和蛋白表達(dá)量對比

由圖3、圖4 可見，8 號的生物量和蛋白表達(dá)量都很高，8 號的培養(yǎng)條件是：搖瓶裝液量為1 200 mL，接種量為20 mL，培養(yǎng)溫度為37℃，搖床轉(zhuǎn)速為130 rpm，誘導(dǎo)時(shí)機(jī)為0.7 時(shí)加入IPTG 0.1 mM，誘導(dǎo)表達(dá)6 h。故而表達(dá)His-prescission 蛋白酶在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)的最佳誘導(dǎo)時(shí)機(jī)為0.7。

表1 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析表

3 總結(jié)

本文利用質(zhì)粒提取試劑盒將含有His-prescission基因的質(zhì)粒從宿主菌BL21(DE3)中提取出來，再分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)-T1R、Rosetta2(DE3)、Origami2(DE3)，以感受態(tài)細(xì)胞作為變量，試管裝液量、搖床轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)溫度、接種量、IPTG 加入量作為固定量，通過單因素實(shí)驗(yàn)得出大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21（DE3）-T1R 為最佳宿主菌。然后采用正交實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步探討His-prescission 蛋白酶在大腸桿菌BL21(DE3)-T1R 中的最佳表達(dá)條件。在正交試驗(yàn)中，以搖床轉(zhuǎn)速代替溶氧量，以IPTG 作為誘導(dǎo)劑，選擇合適的誘導(dǎo)時(shí)機(jī)加入適量的誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)培養(yǎng)一段時(shí)間后檢測其生物量和蛋白表達(dá)效果。以大劑量表達(dá)的方式，通過正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化His-prescission蛋白酶在大腸桿菌中的最佳表達(dá)條件，最佳發(fā)酵工藝參數(shù)：培養(yǎng)基初始pH 7.0，搖床轉(zhuǎn)速130 rpm，搖瓶裝液量1 200 mL，接種量20 mL，培養(yǎng)溫度37℃，OD 值達(dá)到0.7時(shí)，IPTG 0.1 mM/mL，誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間6 h。