于勁松， 徐 斐， 曹 慧， 袁 敏， 葉 泰， 塔瑪夏·提樂努爾，楊 曄， 楊洪志， 王首豐， 張港嘉

上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院， 上海 200093

近年來，隨著環(huán)境污染的惡化，重金屬鎘在食品中污染問題越來越嚴(yán)重[1-3]。目前食品中鎘污染嚴(yán)重主要是由于用含鎘污水灌溉農(nóng)田，間接地危及了水生生物與人類安全。鎘在人體內(nèi)主要積聚在肝、腎和內(nèi)分泌腺中，代謝和被清除的速度緩慢。我國國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2762——2005《食品中污染物限量》規(guī)定了大米、大豆中鎘的限量≤0.2 mg/kg，花生≤0.5 mg/kg，面粉、雜糧等≤0.1 mg/kg；畜禽肉類≤0.1 mg/kg，肝臟≤0.5 mg/kg，而腎臟≤1.0 mg/kg[4]。

以分子印跡技術(shù)為基礎(chǔ)發(fā)展起來的離子印跡聚合技術(shù)，為當(dāng)前重金屬特異性結(jié)合材料的探索帶來了新思路，通過該技術(shù)可以制備一種空間結(jié)構(gòu)和結(jié)合位點(diǎn)與特定目標(biāo)離子互補(bǔ)并匹配的聚合物[5-12]。分子印跡技術(shù)中，功能單體的選擇是很重要的一個(gè)步驟，選擇的功能單體需要與模板分子結(jié)合形成穩(wěn)定的復(fù)合物，這樣制備出來的印跡聚合物(MIP)上可以形成功能單體與模板分子相匹配的印跡空穴，因此在制備Cd(II)離子印跡聚合物的過程中，需要篩選出與Cd(II)結(jié)合效果最好的功能單體[13-24]。針對(duì)篩選對(duì)象，提出采用電導(dǎo)法用于離子印跡聚合物功能單體篩選。電導(dǎo)法就是依靠物質(zhì)電導(dǎo)率這一特性用來篩選分子印跡聚合物功能單體的方法，電導(dǎo)率是溶質(zhì)溶解在某一溶劑里的導(dǎo)電性能，電導(dǎo)率越大，導(dǎo)電性能越良好，對(duì)于電導(dǎo)率而言，影響其大小的因素主要是溫度，溶液中溶質(zhì)種類。濃度相同的不同物質(zhì)在相同溫度下，其電導(dǎo)率是不同的。試驗(yàn)中，我們假設(shè)篩選的配體在溶液中與鎘發(fā)生結(jié)合，生成的物質(zhì)的導(dǎo)電性與配體和鎘都會(huì)有所差別，因此可以通過反應(yīng)前后電導(dǎo)率的變化情況去判斷配體是否與鎘發(fā)生反應(yīng)，以及不同配體與鎘反應(yīng)的強(qiáng)弱。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

(1) 氨基酸類：包括半胱氨酸(Cys)、天冬氨酸(Asp)、甘氨酸(Gly)等在內(nèi)的具有水溶性的17種氨基酸、谷胱甘肽(GSH)(優(yōu)級(jí)純)。

(2) 核苷酸：8種核苷酸：腺嘌呤脫氧核苷酸(dAMP)，鳥嘌呤脫氧核苷酸(dGMP)，胞嘧啶脫氧核苷酸(dCMP)，胸腺嘧啶脫氧核苷酸(dTMP)，腺嘌呤核糖核苷酸(AMP)，胞嘧啶核糖核苷酸(CMP)，鳥嘌呤核糖核苷酸(GMP)，尿嘧啶核糖核苷酸(UMP)，核苷：胞苷、尿苷、腺苷、d胸苷等。

(3)二硫蘇糖醇(DTT)、磷酸鹽：焦磷酸鈉、十二水磷酸氫二鈉、葡萄糖-6-磷酸鈉、無水磷酸鈉；HEPES(4-羥乙基哌嗪乙磺酸)緩沖液，氫氧化鈉，鹽酸等。

1.2 儀器與設(shè)備

低溫恒溫循環(huán)器、恒溫震蕩儀、磁力攪拌器、LXJ-IIB離心機(jī)、電導(dǎo)率儀、pH計(jì)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1緩沖液、單體、模板溶液的配置

本研究選用的緩沖液是非離子緩沖液HEPES，選用非離子型緩沖液可以減少實(shí)驗(yàn)過程中緩沖背景對(duì)電導(dǎo)率測試的干擾；配置了不同pH的HEPES的緩沖液：6.8、7.15、7.5、7.85、8.2。單體母液的配置濃度為10 mmol/L(HEPES配置)；模板選用的是氯化鎘，模板的母液濃度為0.1 mol/L。

為了測量功能單體和隔離子結(jié)合的電導(dǎo)率變化，需要比較不同濃度下，結(jié)合后的功能單體和鎘離子的緩沖液體系與未結(jié)合的功能單體和鎘離子的緩沖液體系的電導(dǎo)率的差值。這里定義并配制了A、B、C、D四種溶液，A是僅含有鎘離子的緩沖液；B是僅含有功能單體的緩沖液，C是含有功能單體和鎘離子的緩沖液體系，D是HEPES緩沖液。其中B和C兩種溶液，B1～B4中單體的濃度為1 mmol/L、2 mmol/L、3 mmol/L、4 mmol/L，C1～C4中鎘離子的濃度為1 mmol/L，功能單體的濃度為1 mmol/L、2 mmol/L、3 mmol/L、4 mmol/L。

1.3.2電導(dǎo)率差值的定義

為了更好地處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與分析結(jié)果，研究中定義了一個(gè)電導(dǎo)率差值的物理量。假設(shè)篩選的單體在溶液中與鎘發(fā)生結(jié)合，生成的物質(zhì)的電導(dǎo)率與單體以及鎘溶液的電導(dǎo)率之和會(huì)有所差別。

電導(dǎo)率差值：Δσ=A-D+(B-D)-(C-D)=A+B-C-D。

公式中，A值代表氯化鎘緩沖液的電導(dǎo)率，B值單體緩沖液的電導(dǎo)率，C值單體和氯化鎘經(jīng)一定比例混合后的電導(dǎo)率，D值是緩沖液的電導(dǎo)率。A～D：氯化鎘加入到緩沖液后體系電導(dǎo)率變化量，B～D：單體加入到緩沖液后體系電導(dǎo)率變化量，C～D：氯化鎘和單體同時(shí)加入到緩沖液后體系電導(dǎo)率變化量。電導(dǎo)率差值(Δσ)反映的是功能單體與鎘結(jié)合強(qiáng)弱，Δσ越大表明該功能單體與重金屬鎘離子的結(jié)合能力越強(qiáng)。

2 結(jié)果與討論

2.1 氨基酸作為功能單體與鎘結(jié)合前后的電導(dǎo)率測試研究

研究中，共考察了17種氨基酸作為功能單體時(shí)，與鎘結(jié)合前后的電導(dǎo)率變化，試驗(yàn)結(jié)果如下圖所示：

圖1 氨基酸與鎘的結(jié)合篩選結(jié)果

由圖1可見，17中氨基酸中半胱氨酸的Δσ最高，在100到110之間；天冬氨酸、天冬酰胺以及谷氨酸的電導(dǎo)率差值位于第二梯隊(duì)，大約在15到30之間；其它氨基酸的電導(dǎo)率差值都在15以下，說明它們與鎘的結(jié)合能力較弱。除了半胱氨酸以外，其他氨基酸的電導(dǎo)率差值都隨單體濃度增高而升高。從結(jié)構(gòu)上看，這17種氨基酸可以分為兩類：含巰基和不含巰基，其中含有巰基的只有半胱氨酸一種，而它的Δσ也遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他的16種氨基酸。在Dokmanic等人的研究中也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象，他們從PDB數(shù)據(jù)庫里選了大約10 000種蛋白質(zhì)與金屬離子結(jié)合，結(jié)果發(fā)現(xiàn) Cd 與氨基酸形成的結(jié)合物 35%以上的配位數(shù)(CN，coordination number)為 4，而當(dāng)配位數(shù)為4時(shí)，鎘離子傾向于和巰基中的硫結(jié)合。說明巰基可能在鎘離子和氨基酸結(jié)合的過程中起到很重要的作用。為了驗(yàn)證這個(gè)觀點(diǎn)我們又設(shè)計(jì)另一組試驗(yàn)來研究影響半胱氨酸與鎘離子結(jié)合性能的主要基團(tuán)。

不含巰基的氨基酸中，天冬氨酸結(jié)構(gòu)中相比較其它的氨基酸，多了一個(gè)羧基-COOH，天冬氨酸σ值高于其它氨基酸，推測-COOH對(duì)試驗(yàn)的影響比較大。

2.2 影響半胱氨酸與鎘離子結(jié)合性能的主要基團(tuán)

在上組試驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)了半胱氨酸與鎘離子有較好的結(jié)合性，我們推測可能是巰基在半胱氨酸與鎘離子結(jié)合過程中起到了主要作用。為了驗(yàn)證這個(gè)觀點(diǎn)，我們分別選用了二硫蘇糖醇(DTT),半胱氨酸(Cys)和谷胱甘肽(GSH)三種含巰基的單體。按照之前的試驗(yàn)步驟，分別研究這三種單體與1 mmol/L ～4 mmol/L這四種濃度的鎘離子單體結(jié)合后的電導(dǎo)率變化。其結(jié)果如圖2所示。

圖2 三種含巰基單體與鎘的結(jié)合特性

圖中的三條曲線分別是二硫蘇糖醇，半胱氨酸和和谷胱甘肽與鎘離子結(jié)合的電導(dǎo)率變化趨勢(shì)。它們的電導(dǎo)率差值都很大，在95～110之間，這充分說明了含巰基的單體與鎘離子有較好的結(jié)合率。其中谷胱甘肽是由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸組成的三肽，它和鎘離子結(jié)合后的電導(dǎo)率差值很高，而谷氨酸，甘氨酸與鎘離子結(jié)合的電導(dǎo)率差值都很低，這反應(yīng)了與鎘離子有良好結(jié)合性能的應(yīng)該是半胱氨酸含有的基團(tuán)。二硫蘇糖醇含有兩個(gè)巰基，其電導(dǎo)率的差值也比半胱氨酸和和谷胱甘肽要高(高了大約5左右)，這也說明巰基確實(shí)有較好的與鎘離子結(jié)合的能力。以上的試驗(yàn)結(jié)果符合經(jīng)典的軟硬酸堿理論：按照該理論對(duì)物質(zhì)進(jìn)行的劃分，鎘離子屬于軟酸，含巰基物質(zhì)屬于軟堿，軟酸傾向于和軟堿結(jié)合。因此，含巰基的半胱氨酸、谷胱甘肽和二硫蘇糖醇等具有較強(qiáng)的與鎘離子結(jié)合的能力。

綜上，氨基酸的篩選試驗(yàn)結(jié)果表明，-SH使得氨基酸與Cd(II)的結(jié)合能力更強(qiáng)，所以半胱氨酸的試驗(yàn)效果最好，因此在氨基酸篩選試驗(yàn)中，我們選擇半胱氨酸作為后面的待篩功能單體。

2.3 核苷酸作為功能單體與鎘結(jié)合前后的電導(dǎo)率測試研究

在篩選核苷酸與鎘結(jié)合能力的實(shí)驗(yàn)中，我們選取了8種核苷酸作為我們的實(shí)驗(yàn)單體。試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示：

圖3 核苷酸與鎘結(jié)合前后的電導(dǎo)率差值

從圖中可以看出dGMP和GMP與鎘離子結(jié)合的產(chǎn)生的電導(dǎo)率差值最高，數(shù)值在60到105之間，其次是腺苷酸和尿苷酸，數(shù)值在60到90之間，剩余的四種核苷酸電導(dǎo)率的差值基本相近在20到60之間。與17種氨基酸比較，核苷酸的電導(dǎo)率差值普遍較高，可見核苷酸是一種優(yōu)異的金屬離子配體，有很好的配位性能。與氨基酸不同的是，核苷酸的結(jié)合能力差距并沒有這么明顯。

2.4 影響核苷酸與鎘離子結(jié)合性能的主要基團(tuán)

為了進(jìn)一步研究核苷酸與鎘離子的結(jié)合性能，我們選擇從核苷酸的組成入手分析。核苷酸的結(jié)構(gòu)包含了磷酸，戊糖和堿基三個(gè)部分，通過將磷酸鹽附在核苷的糖環(huán)5，上，就會(huì)形成核苷酸。而這些磷酸鹽數(shù)量從一個(gè)到三個(gè)不等，本試驗(yàn)選取的都是含有一個(gè)磷酸的核苷酸。

研究過程中共選擇了四種磷酸鹽：焦磷酸鈉、無水磷酸三鈉、磷酸氫二鈉(12水)、葡萄糖-6-磷酸鈉，考察它們與鎘離子的結(jié)合情況，其結(jié)果如圖3所示。

圖4 磷酸鹽與鎘結(jié)合電導(dǎo)率差值變化

從圖中可以看出，含有兩個(gè)磷酸基團(tuán)的焦磷酸鈉電導(dǎo)率差值最大，在150到170之間，其次的是無水磷酸三鈉和十二水磷酸氫二鈉，電導(dǎo)率差值在60到120之間，最低的是葡萄糖-6-磷酸鈉，電導(dǎo)率差值在20到60之間?？傮w上，含磷酸物質(zhì)與鎘離子的結(jié)合能力都很好，且含有的磷酸基團(tuán)越多，與鎘離子結(jié)合性能越好。而R基的不同，也會(huì)影響與鎘離子的結(jié)合性能。這個(gè)試驗(yàn)也可以證明磷酸基團(tuán)確實(shí)與鎘離子有很好的結(jié)合能力。

核苷酸的結(jié)構(gòu)中還有核苷，在篩選核苷與鎘結(jié)合能力的實(shí)驗(yàn)中，我們選取了4種核苷作為我們的實(shí)驗(yàn)單體，依次為胞苷、尿苷、腺苷與脫氧胸苷，其他幾種核苷難溶于水，因此暫且考察了4種核苷。試驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，結(jié)果顯示：四種核苷的電導(dǎo)率差值都很低，可見它們與鎘的結(jié)合能力都非常弱，幾乎可以忽略不計(jì)。

圖5 四種核苷與鎘結(jié)合前后的電導(dǎo)率差值

綜合圖3，圖4和圖5的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，可以確定的是：八種核苷單磷酸結(jié)構(gòu)中的磷酸基團(tuán)是可以與鎘發(fā)生較強(qiáng)親和的部位(圖4)；但核苷酸與金屬離子鎘的結(jié)合能力又是有大有小的(圖3)，可見磷酸并不是唯一的親合部位?？梢酝茰y，核苷酸中的堿基部分理應(yīng)與鎘離子有親和作用。但圖5的實(shí)驗(yàn)結(jié)果又是與推測矛盾的。可以給一個(gè)這樣的解釋：單獨(dú)的堿基與鎘離子不能發(fā)生親合，它與鎘離子產(chǎn)生親合是需要條件的，需借助磷酸基團(tuán)的存在時(shí)才可體現(xiàn)出來。磷酸基團(tuán)起的作用像是打開堿基與鎘親和力的開關(guān)，或者類似一個(gè)“催化劑”的作用一樣。

2.5 功能單體與鎘離子結(jié)合所需pH的優(yōu)化分析

研究中考察了本實(shí)驗(yàn)中緩沖液的最適pH, HEPES緩沖液的緩沖范圍是6.8～8.2，我們?cè)谶@個(gè)范圍中進(jìn)行了多次實(shí)驗(yàn)，并用了之前實(shí)驗(yàn)的大部分單體來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以找到最適用于試驗(yàn)的pH。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中我們可以發(fā)現(xiàn)，所有單體在pH 6.8到8.2的范圍內(nèi)的電導(dǎo)率差值都是先上升再下降，在緩沖液pH 7.5時(shí)，單體的電導(dǎo)率差值最高，并且?guī)缀跛袉误w都呈現(xiàn)此種趨勢(shì)，因此可選擇7.5作為最優(yōu)的單體與鎘結(jié)合的pH條件。

圖6 單體與鎘結(jié)合后電導(dǎo)率差值與pH的關(guān)系

3 結(jié)論

離子印跡技術(shù)作為新興的特異性檢測和去除重金屬離子的技術(shù)，目前面臨的主要難點(diǎn)在于功能單體的選擇，常用的幾種分子印跡聚合物都無法很好與重金屬離子特異性的結(jié)合，而國內(nèi)外關(guān)于相關(guān)功能單體的研究還比較少。本文通過研究鎘離子與功能單體的結(jié)合，希望給之后的功能單體選擇研究提供一些幫助。通過實(shí)驗(yàn)得到的主要結(jié)論是：(1) 鎘離子是一種軟酸，巰基是一種弱堿，根據(jù)軟硬酸堿理論，軟酸易于軟堿發(fā)生反應(yīng)。所以鎘離子與巰基有很好的結(jié)合性能；(2) 磷酸根帶有很多的負(fù)電荷，易于含有正電荷的鎘離子通過靜電作用結(jié)合；(3) 在此過程中還優(yōu)化了緩沖液的pH，通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)緩沖液在 pH為7.5時(shí)為最優(yōu)。

雖然通過電導(dǎo)率法篩選與鎘結(jié)合的功能單體簡單又方便，但是這種方法依然存在著很多不可忽視的問題：(1) 在實(shí)驗(yàn)中測出某些單體電導(dǎo)率差值為負(fù)數(shù)，還未能找出合理的原因來解釋此種問題；(2) 由于時(shí)間有限，現(xiàn)在篩選的功能單體較少，可能存在其他與鎘有更好結(jié)合能力的功能單體。