沙俊濤 陳青青 繆雨靜 屈仁軍 唐曉清 房婉萍

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，江蘇 南京 210095)

化感作用是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中重要的化學(xué)生態(tài)現(xiàn)象。 研究藥用植物與其他植物之間的化感作用，建立合理的輪作、間作和套作的耕作制度，能夠有效地控制田間雜草、降低作物之間的負(fù)效應(yīng)，提高藥材的質(zhì)量、產(chǎn)量和土地的產(chǎn)出率[1]。 植物殘?bào)w凋落物分解是化感物質(zhì)釋放的途徑之一。 通過雨霧淋溶、微生物、動植物與人類活動等直接或間接參與植物殘?bào)w凋落物的破碎、搬運(yùn)等過程，這些植物殘?bào)w在分解過程中釋放出化感物質(zhì)，進(jìn)入土壤發(fā)揮化感作用，直接或間接對鄰近的微生物、動植物及自身的生長發(fā)育產(chǎn)生抑制或促進(jìn)作用[2]。

茶樹(Camellia sinensis)為山茶科山茶屬多年生常綠小灌木，是我國傳統(tǒng)的經(jīng)濟(jì)作物。 我國茶園常采用單行雙株，行距120 cm，間距25 ～28 cm 的種植方式[3]。 茶農(nóng)往往間作種植其他植物以改變長期單一種植茶樹引起的土壤酸化、土壤結(jié)構(gòu)變差等問題[4]。研究發(fā)現(xiàn)，茶園種植銀杏(Ginkgo biloba)、 紫蘇(Ocimum basilicum)、龍膽(Gentiana rigescens)等藥用植物，不僅可以有效地利用化感作用控制田間雜草，改善茶園的土壤物理性狀及養(yǎng)分，增加生態(tài)系統(tǒng)的多樣性，同時(shí)還能提高藥材的質(zhì)量、產(chǎn)量、活性成分以及茶葉的品質(zhì)，這種“茶樹＋藥用植物”組合的新發(fā)展模式正在成為發(fā)展生態(tài)茶園經(jīng)濟(jì)的熱點(diǎn)[5-7]。 茶樹為常綠植物，每月都會發(fā)生茶樹葉片的脫離，據(jù)報(bào)道，茶樹在5 月落葉量最多，約50 g·m-2，在1 月落葉量最少，約6 g·m-2[8]。 研究表明，茶樹殘?bào)w凋落物在分解過程中會釋放多酚類、有機(jī)酸類、咖啡堿等化感物質(zhì)，這些物質(zhì)進(jìn)入茶園土壤會導(dǎo)致土壤酸化，影響周圍其他植物的生長[4，9-10]，因此選擇適宜的藥用植物間作是提升生態(tài)茶園中茶葉和藥用植物產(chǎn)量與品質(zhì)的關(guān)鍵。 菘藍(lán)(Isatis indigoticaFort.)為十字花科菘藍(lán)屬兩年生草本植物，其干燥葉入藥為大青葉，具有清熱解毒、涼血消斑的功效[11]。 菘藍(lán)適宜生長在中性或弱酸性的土壤，陳平[12]發(fā)現(xiàn)菘藍(lán)-核桃林藥復(fù)合系統(tǒng)可以改善土壤水分狀況、降低耗水量、提高水分利用效率及產(chǎn)值，為菘藍(lán)能夠種植于茶園提供了理論基礎(chǔ)和現(xiàn)實(shí)依據(jù)。 但目前尚不清楚茶樹凋落葉化感作用對菘藍(lán)生長和品質(zhì)產(chǎn)生的影響。 為此，本研究以茶樹凋落葉浸提液(leaf litter extracts ofC. sinensis，LLEC)為供體，模擬茶樹殘?bào)w分解和淋溶條件下的茶園微環(huán)境，通過測定LLEC處理后菘藍(lán)細(xì)胞膜損傷率、抗氧化酶活性及其基因表達(dá)量、可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、過氧化氫(H2O2)、靛玉紅、靛藍(lán)和總黃酮含量等指標(biāo)，探討茶園環(huán)境對菘藍(lán)生長的化感作用，以期為幼齡茶園茶-藥復(fù)合種植模式的推廣提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)于2017 年12 月中旬，在江蘇省南京中山陵茶廠雨花茶生產(chǎn)基地(32.05°N，118.84°E)進(jìn)行。 隨機(jī)收集掉落在地面的雨花茶樹的干枯葉片，自然陰干，粉碎過65 目篩，于陰涼干燥處保存?zhèn)溆谩?受試材料為安徽亳州菘藍(lán)居群，經(jīng)南京農(nóng)業(yè)大學(xué)王康才教授鑒定為十字花科菘藍(lán)(Isatis indigoticaFort.)的角果(生產(chǎn)中稱為種子)。

1.2 茶樹凋落葉浸提液的制備

水浸提法是研究植物化感作用的常用方法[13]，茶樹凋落葉的浸提液能較好地模擬茶園的環(huán)境。 稱取50 g 茶樹凋落葉粉末，置于錐形瓶中，加入1 000 mL蒸餾水，定期攪拌振蕩，浸泡48 h 后用4 層滅菌醫(yī)用紗布過濾，得到濃度為50 mg·mL-1的茶樹凋落葉浸提液。 參照鄧騖遠(yuǎn)[14]茶樹葉水浸提液的濃度梯度，并通過前期預(yù)試驗(yàn)對茶樹凋落葉浸提液濃度做出適當(dāng)調(diào)整，從中篩選出5 個(gè)濃度梯度，用去離子水將母液分別配置成6.25、12.5、25 和50 mg·mL-1的處理液，記作T1、T2、T3、T4；以去離子水作對照，記作CK，置于4℃冰箱待用。 同時(shí)用pH-20＋筆式pH 計(jì)(杭州齊威儀器有限公司)測定CK、T1、T2、T3、T4 5 種溶液的pH 值分別為7.0、6.1、5.8、5.5、5.1。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2018 年4 月2 日播種，選取成熟度一致的菘藍(lán)種子，基質(zhì)為蛭石和珍珠巖，比例為1 ∶2。 待幼苗長出6 片真葉時(shí)，選擇長勢一致的幼苗移栽至塑料盆(高15 cm，直徑20 cm，基質(zhì)重1 kg)，每盆6 株幼苗，按CK、T1、T2、T3、T4 設(shè)置5 個(gè)處理，每個(gè)處理10 盆，置于大棚內(nèi)避雨處理，每隔3 d 澆灌1 次不同濃度的浸提液，每次50 mL，保持基質(zhì)濕潤(根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，每千克基質(zhì)每次澆灌50 mL 浸提液可保持基質(zhì)濕度基本不變，接近自然條件下雨霧淋溶后土壤濕潤的狀態(tài))。 60 d 后結(jié)束澆灌(該時(shí)期與實(shí)際生產(chǎn)中第一茬大青葉采收期基本一致)，進(jìn)行形態(tài)指標(biāo)、生理生化指標(biāo)的測定。

1.4 測定項(xiàng)目與方法

1.4.1 菘藍(lán)生長指標(biāo)的測定 隨機(jī)從塑料盆中選取10 株菘藍(lán)，洗凈拭干后測定其生物量、株高等生長指標(biāo)，隨后105℃殺青15 min，60℃烘干至恒重。 干燥葉粉碎后過65 目篩，用于總黃酮、靛藍(lán)和靛玉紅含量的測定。

葉面積:隨機(jī)選取各處理相同部位平整完整的菘藍(lán)葉片，采用LI-3000C 型便攜式葉面積儀(北京力高泰科技有限公司)測定葉面積。

1.4.2 可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量的測定 參照王學(xué)奎[15]的方法。 取菘藍(lán)相同部位的葉片0.1 g，采用蒽酮法測定可溶性糖含量；同上，取0.5 g 葉片采用考馬斯亮藍(lán)染色法測定可溶性蛋白質(zhì)含量；另取0.5 g 葉片采用茚三酮法測定脯氨酸含量。 每次試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.4.3 MDA、H2O2含量和細(xì)胞損傷率的測定 取菘藍(lán)相同部位的葉片0.5 g， 采用硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，TBA)法測定MDA 含量[15]。 同1.4.2，取葉片2 g，置于40℃恒溫箱內(nèi)萎蔫1 h，經(jīng)真空干燥機(jī)處理后在20 ～25℃恒溫靜置20 min，用EC-861 筆式電導(dǎo)儀(EXTECH，美國)測定電導(dǎo)率，再放入100℃沸水浴15 min，冷卻后在20～25℃恒溫下測定其煮沸電導(dǎo)率，按照公式計(jì)算細(xì)胞膜損傷率:

細(xì)胞膜損傷率＝處理電導(dǎo)率/煮沸電導(dǎo)率×100%。

同上，取葉片0.1 g，利用南京建成生物研究所提供的試劑盒測定H2O2含量。 每次試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.4.4 抗氧化酶活性的測定 取菘藍(lán)相同部位的葉片0.5 g，利用南京建成生物研究所提供的試劑盒測定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化物酶(peroxidase，POD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)和抗壞血酸氧化物酶(ascorbate peroxidase，APX)活性。每次試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.4.5 抗氧化酶基因表達(dá)量分析 利用EASY spin植物RNA 快速提取試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司)提取菘藍(lán)葉片的RNA，并以1.6%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 的完整性，測定其濃度和純度；cDNA 的合成和熒光定量表達(dá)量參照試劑盒說明書操作。 定量PCR 反應(yīng)體系為20 μL:Real-time PCR Master Mix 10 μL，ddH2O 5.6 μL，template DNA 2 μL，Primer 2 μL，50×ROX1 0.4 μL。 PCR 擴(kuò)增程序:94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸2 min，循環(huán)15次；72℃延伸5 min，15℃保存。 采用primer premier 5設(shè)計(jì)引物序列(表1)。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 引物序列Table 1 Real-time PCR primer sequences

表2 茶樹凋落葉浸提液對菘藍(lán)生長的影響(n＝10)Table 2 Effect of LLEC on growth of I. indigotica (n＝10)

1.4.6 靛藍(lán)和靛玉紅含量的測定 取0.1 g 干燥菘藍(lán)葉片粉末，參照《中華人民共和國藥典》 (2015版)[11]略作修改， 采用超高效液相色譜(ultra performance liquid chromatography， UPLC)法測定靛玉紅和靛藍(lán)的含量。 色譜條件:分析柱(Aglient ZORBA×Eclidise Plus C18)柱溫30℃；流動相為v(甲醇) ∶v(水)＝72 ∶28；流速0.30 mL·min-1；檢測波長289 nm；進(jìn)樣體積2 μL。 以靛玉紅和靛藍(lán)的色譜峰面積為縱坐標(biāo)，其對應(yīng)的含量為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。 靛玉紅的回歸方程為:y＝158.39x-72.629，R2＝0.997(n＝3)，線性范圍:0 ～10 μg·mL-1；靛藍(lán)的回歸方程為:y＝16.55x＋84.195，R2＝0.998(n＝3)，線性范圍:0～2 μg·mL-1。 每次試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.4.7 總黃酮含量的測定 取0.1 g 干燥菘藍(lán)葉片粉末，參照Liu 等[16]的方法提取菘藍(lán)葉粉末中的總黃酮，并通過AlCl3比色法[17]以蘆丁為對照品繪制得到標(biāo)準(zhǔn)曲線來計(jì)算總黃酮含量。 每次試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2017 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用SPSS 19.0對結(jié)果進(jìn)行方差分析和相關(guān)性分析。 采用Pearson 相關(guān)性分析法對抗氧化酶及其基因表達(dá)量進(jìn)行雙變量相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹凋落葉浸提液對菘藍(lán)生長的影響

由表2 可知，經(jīng)茶樹調(diào)落葉浸提液處理后，菘藍(lán)的葉面積、根長、株高、鮮重和根冠比均呈先上升后下降的趨勢，各項(xiàng)生長指標(biāo)均在T1 時(shí)達(dá)到最大值。 這是因?yàn)椴铇涞蚵淙~中少量的化感物質(zhì)能夠刺激菘藍(lán)根系生長，增加植株的根冠比，保障地上部生長所需的養(yǎng)分供給，進(jìn)而促進(jìn)葉面積、株高、鮮重增加。 隨著茶樹調(diào)落葉浸提液濃度的升高，其對菘藍(lán)生長的化感抑制作用逐漸增強(qiáng)，其中T4 受到的化感抑制作用最強(qiáng)，與CK相比，T4 葉面積、根長、株高、鮮重和根冠比分別下降了60.56%、43.30%、24.80%、60.00%、26.67%。 當(dāng)茶樹調(diào)落葉浸提液濃度小于12.5 mg·mL-1(T2)時(shí)不會影響菘藍(lán)的存活率，而浸提液濃度超過25 mg·mL-1(T3)時(shí)植株出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，存活率下降。

2.2 茶樹凋落葉浸提液對可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸含量的影響

由表3 可知，隨著茶樹調(diào)落葉浸提液濃度的升高，菘藍(lán)葉片中的可溶性糖含量呈先上升后下降的趨勢，T3 的可溶性糖含量最高，為CK 的1.41 倍，T4 的可溶性糖含量與其他處理相比顯著降低(P＜0.05)。 T1 的可溶性蛋白含量與CK 間無顯著差異(P＞0.05)，而T2、T3、T4 的可溶性蛋白含量持續(xù)降低，較CK 分別顯著下降了12.35%、21.61%、40.14%。 葉片的脯氨酸含量隨著茶樹調(diào)落葉浸提液濃度的升高整體呈增加趨勢，且浸提液處理組的脯氨酸含量均顯著高于CK(P＜0.05)，T1、T2、T3、T4 的脯氨酸含量分別是CK 的1.10、1.08、1.59 和2.10 倍。

表3 茶樹凋落葉浸提液對菘藍(lán)可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸含量的影響(n＝3)Table 3 Effects of LLEC on the content of soluble sugar， soluble protein and proline in I.indigotica(n＝3)

2.3 茶樹凋落葉浸提液對菘藍(lán)細(xì)胞膜損傷率、MDA、H2O2 含量的影響

T1 菘藍(lán)葉片中的MDA 含量與CK 相比無顯著差異(P＞0.05)，而隨著茶樹凋落葉浸提液濃度的升高，T2、T3、T4 的MDA 含量均較CK 顯著增加(P＜0.05)，增幅分別為27.82%、28.85%、44.84%(圖1-A)。 與CK 相比，T1、T2 菘藍(lán)葉片的細(xì)胞膜損傷率和H2O2含量差異不顯著(P＞0.05)，而T3、T4 的細(xì)胞膜損傷率和H2O2含量均顯著升高(P＜0.05)(圖1-B、C)。

2.4 茶樹凋落葉浸提液對菘藍(lán)抗氧化酶系統(tǒng)的影響

2.4.1 抗氧化酶活性及其基因表達(dá)量 由圖2 可知，不同濃度茶樹凋落葉浸提液處理后，菘藍(lán)的抗氧化酶系統(tǒng)受到了不同程度的損傷。 與CK 相比，T1 的SOD活性差異不顯著(P＞0.05)，而T2、T3、T4 的SOD 活性均顯著降低(P＜0.05)。 T1 的POD 和APX 活性最高，與CK 相比分別提高了12.93%、13.81%。 T1 與T2 的CAT 活性高于CK，其中T2 活性顯著高于CK(P＜0.05)，T3 與T4 的CAT 則顯著低于CK(P＜0.05)。當(dāng)浸提液濃度大于25 mg·mL-1(T3)時(shí)，茶樹凋落葉浸提液對菘藍(lán)抗氧化酶活性的抑制作用增強(qiáng)，T3、T4 的4 種抗氧化酶活性均顯著低于CK(P＜0.05)。

由圖3 可知，茶樹凋落葉浸提液會影響菘藍(lán)的抗氧化酶基因表達(dá)，總體上，隨著浸提液濃度的升高，4種抗氧化酶基因表達(dá)量均呈先上升后下降的趨勢。T1 的Pod、Cat、Apx基因表達(dá)量最高，而其Fesod基因表達(dá)量與CK 相比差異不顯著(P＞0.05)。 T2 的Fesod和Pod基因表達(dá)量均顯著高于CK(P＜0.05)，而Cat、Apx基因表達(dá)量與CK 相比差異不顯著(P＞0.05)。 T4的4 種抗氧化酶基因表達(dá)量均最低，且顯著低于CK(P＜0.05)。

2.4.2 抗氧化酶活性及其基因表達(dá)量的相關(guān)性 由表4 可知，POD 活性與其基因表達(dá)量的相關(guān)系數(shù)為0.92，呈著正相關(guān)性(P＜0.05)。 SOD、CAT 和APX 活性與其基因表達(dá)量相關(guān)性不顯著。

表4 抗氧化酶活性及其基因表達(dá)量的相關(guān)系數(shù)Table 4 Correlation coefficients of antioxidant enzyme activities and gene expressions

圖1 茶樹凋落葉浸提液對菘藍(lán)MDA 含量(A)、細(xì)胞膜損傷率(B)、H2O2 含量(C)的影響(n＝3)Fig.1 Effects of LLEC on MDA content(A)， cell membrane damage(B)， H2O2 content(C) of I. indigotica(n＝3)

圖2 茶樹凋落葉浸提液對菘藍(lán)SOD(A)、POD(B)、CAT(C)和APX(D)活性的影響(n＝3)Fig.2 Effects of LLEC on the activities of SOD(A)， POD(B)， CAT(C) and APX(D) in I. indigotica (n＝3)

圖3 茶樹凋落葉浸提液對菘藍(lán)Fesod(A)、Pod(B)、Cat(C)、Apx(D)基因相對表達(dá)量的影響(n＝3)Fig.3 Effects of LLEC on relative expression level of Fesod(A)、Pod(B)、Cat(C)、Apx(D)in I. indigotica (n＝3)

2.5 茶樹凋落葉浸提液對菘藍(lán)葉內(nèi)靛玉紅、靛藍(lán)和總黃酮含量的影響

隨著茶樹調(diào)落葉浸提液濃度的升高，菘藍(lán)葉內(nèi)的先上升后下降的趨勢，與CK 相比，T1、T2 的靛藍(lán)含量顯著增加(P＜0.05)，增幅分別為29.65%、33.82%，T3、T4 的靛藍(lán)含量顯著減少(P＜0.05)，靛藍(lán)含量呈降幅分別為13.90%、42.64%(圖4-A)；菘藍(lán)葉片內(nèi)靛玉紅含量，T1 最高，T1 和T4 均顯著高于CK(P＜0.05)，而T3 與CK 相比差異不顯著(P＞0.05)(圖4-B)；葉片總黃酮含量隨著浸提液濃度的升高持續(xù)增加，T4 的總黃酮含量最高，較CK 顯著增加了32.97%(圖4-C)。

3 討論

3.1 菘藍(lán)生長對茶樹潛在化感物質(zhì)的響應(yīng)

菘藍(lán)分布廣，對環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，是發(fā)展林藥復(fù)合種植模式的重要藥用植物，目前核桃林[12]、油茶林、側(cè)柏林、落葉松林[18]等均能復(fù)合種植菘藍(lán)。 在林藥復(fù)合種植模式下，藥用植物的化感作用是判斷其適應(yīng)性的重要指標(biāo)。 王道金等[19]通過分析知母、桔梗、白術(shù)、板藍(lán)根和紫丹參的光響應(yīng)參數(shù)，并對其根部浸提液進(jìn)行生物測定，發(fā)現(xiàn)菘藍(lán)、知母、紫丹參較適宜在楊樹林下種植。 由于化感物質(zhì)的雙重質(zhì)量濃度效應(yīng)，同一化感物質(zhì)對受體植物的生長，可能會出現(xiàn)“低促高抑”的現(xiàn)象[20]。 如低濃度的核桃葉水浸提液對白術(shù)幼苗的生物量、地徑、株高等生長指標(biāo)有促進(jìn)作用，而高濃度則抑制其生長[21]。 本研究同樣發(fā)現(xiàn)，LLEC 對菘藍(lán)生長表現(xiàn)出低濃度促進(jìn)、高濃度抑制的作用特征，當(dāng)浸提液濃度為6.25 mg·mL-1(T1)時(shí)，菘藍(lán)的單株鮮重、葉面積、株高、根長和根冠比高于CK，說明茶樹凋落葉分解過程中，少量的化感物質(zhì)有利于菘藍(lán)的根系伸長和根冠比增加，保障地上部生長所需的養(yǎng)分供給，促進(jìn)植株生長；而浸提液濃度大于12.5 mg·mL-1(T2)時(shí)，菘藍(lán)的生物量和形態(tài)指標(biāo)都受到不同程度的抑制。 研究發(fā)現(xiàn)，茶樹化感物質(zhì)的產(chǎn)生與種植密度、土壤、溫度、光照等環(huán)境因子有關(guān)，釋放的酚類、有機(jī)酸類、醛類、單萜烯醇和芳香族醇等化感物質(zhì)會影響周圍其他植物的生長[22-23]。 因此，結(jié)合茶園的實(shí)際情況，在種植菘藍(lán)時(shí)，可通過調(diào)整種植密度、勤采茶葉、清理落葉等田間管理，減少化感物質(zhì)的產(chǎn)生，創(chuàng)造有利于菘藍(lán)生長的環(huán)境條件。

3.2 茶樹凋落葉浸提液對菘藍(lán)滲透調(diào)節(jié)的影響

圖4 茶樹凋落葉浸提液對菘藍(lán)葉內(nèi)靛藍(lán)(A)、靛玉紅(B)和總黃酮(C)含量的影響(n＝3)Fig.4 Effects of LLEC on indigo content(A)， indirubin content(B) and total flavonoid content (C) in leaves of I. indigotica (n＝3)

逆境脅迫條件下，植物細(xì)胞內(nèi)的可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量增加，細(xì)胞液濃度升高，以維持細(xì)胞膨壓的正常，增強(qiáng)植物的抗逆性[24]。本研究結(jié)果表明，T1、T2 菘藍(lán)葉片中的可溶性糖、和脯氨酸含量與CK 相比顯著增加，說明在輕度化感脅迫時(shí)，菘藍(lán)可通過增加滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的方式，提高細(xì)胞溶質(zhì)濃度，降低滲透勢，穩(wěn)定膨壓，維持體內(nèi)水分和細(xì)胞生理過程的正常進(jìn)行。 T4 的可溶性糖和可溶性蛋白含量達(dá)到最低值，而脯氨酸含量達(dá)到最大值，可能是因?yàn)榭扇苄蕴堑臐B透調(diào)節(jié)作用具有一定的局限性，重度化感脅迫使菘藍(lán)的滲透調(diào)節(jié)能力降低，導(dǎo)致可溶性糖的合成量減少。 可溶性糖是蛋白質(zhì)合成過程中提供碳架和能量的來源，同時(shí)也能間接轉(zhuǎn)化為脯氨酸，在重度化感脅迫下，當(dāng)可溶性糖和可溶性蛋白合成受阻時(shí)，菘藍(lán)葉片中一部分可溶性糖轉(zhuǎn)化為脯氨酸，導(dǎo)致其含量顯著增加[25]。

3.3 菘藍(lán)抗氧化酶防御系統(tǒng)對茶樹凋落葉浸提液的應(yīng)答

化感物質(zhì)進(jìn)入植物體內(nèi)將打破活性氧生成與清除的平衡狀況，導(dǎo)致植物體活性氧增多，加劇膜質(zhì)過氧化，從而破壞膜結(jié)構(gòu)，增加膜透性，其中間產(chǎn)物自由基和最終產(chǎn)物MDA 會對抗氧化酶系統(tǒng)產(chǎn)生影響[26-27]。研究表明，少量活性氧能夠誘導(dǎo)抗氧化酶基因表達(dá)量上調(diào)，提高抗氧化酶活性[28]；而過量活性氧會破壞抗氧化酶系統(tǒng)，導(dǎo)致抗氧化酶基因表達(dá)量下調(diào)，降低抗氧化酶活性[29-30]。 陳斌等[28]發(fā)現(xiàn)在土荊芥的揮發(fā)油及其2 種主要成分(α-萜品烯和傘花素)的化感脅迫下，玉米幼根抗氧化酶基因的表達(dá)受到影響，抗氧化酶活性下降。 本研究中，T1 菘藍(lán)的Pod、Cat和Apx基因表達(dá)量上調(diào)，POD、CAT 和APX 活性均高于CK，說明低濃度浸提液能夠誘導(dǎo)菘藍(lán)體內(nèi)抗氧化酶基因表達(dá)量上調(diào)，提高抗氧化酶活性，以清除菘藍(lán)體內(nèi)的活性氧，減輕過氧化傷害，維持植株正常的生長發(fā)育。 隨著浸提液濃度的進(jìn)一步提高，T2、T3 和T4 菘藍(lán)的抗氧化酶活性及其基因表達(dá)量總體呈下降趨勢，菘藍(lán)植株的長勢也逐漸變差。 T4 的浸提液濃度超過了菘藍(lán)的耐受閾值，H2O2、MDA 含量增加、細(xì)胞膜損傷率上升，菘藍(lán)抗氧化系統(tǒng)的調(diào)控機(jī)制遭受破壞，F(xiàn)esod、Pod、Cat和Apx基因表達(dá)量均較CK 顯著下調(diào)，4 種抗氧化酶活性也顯著降低，這可能是茶樹凋落葉中的化感物質(zhì)積聚在菘藍(lán)植株體內(nèi)，抗氧化酶系統(tǒng)遭受不同程度的破壞，活性氧大量產(chǎn)生，且未能得到及時(shí)清除，導(dǎo)致細(xì)胞膜嚴(yán)重受損，膜電阻和膜流動性下降，胞內(nèi)物質(zhì)外滲，造成其代謝紊亂[31-32]，最終出現(xiàn)萎蔫甚至死亡的現(xiàn)象。

抗氧化酶基因的表達(dá)水平復(fù)雜，基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平受到植物種類、脅迫類型與強(qiáng)度、組織部位等多種因素的影響[33]。 本研究發(fā)現(xiàn)，在化感脅迫下，POD 活性與基因表達(dá)量呈顯著正相關(guān)，二者變化趨勢基本一致；而SOD、CAT 和APX 活性與其基因表達(dá)量的相關(guān)性不顯著，二者變化趨勢不一致，這可能是因?yàn)榭寡趸富虻膍RNA 在翻譯成蛋白質(zhì)的過程中，化感脅迫產(chǎn)生的過量活性氧，使蛋白質(zhì)翻譯后修飾受到影響，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的功能、結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性發(fā)生改變，影響了抗氧化酶的活性[34]；此外，抗氧化酶活性并不是直接由轉(zhuǎn)錄水平控制，而是由轉(zhuǎn)錄后抗氧化酶系統(tǒng)的調(diào)控作用所決定，多種因素影響抗氧化酶活性及其基因表達(dá)量，因此它們的變化趨勢存在差異[35]。

3.4 茶樹凋落葉浸提液對菘藍(lán)非酶類抗氧化防御系統(tǒng)的影響

植物次生代謝產(chǎn)物(如類黃酮、生物堿等)是非酶類抗氧化防御系統(tǒng)中清除活性氧的物質(zhì)[36]。 在環(huán)境脅迫下(如鹽脅迫、高溫、干旱等)，藥用植物體內(nèi)將發(fā)生一系列變化以適應(yīng)環(huán)境，類黃酮、生物堿等次生代謝產(chǎn)物在植物體內(nèi)積累防止植物被氧化損傷，提高對環(huán)境脅迫的適應(yīng)和競爭能力[37-38]。 前人研究結(jié)果表明，在中度水分脅迫下，菘藍(lán)的靛玉紅含量增加[39]；在水分脅迫下，黃芩葉中總黃酮含量明顯增加，根中總黃酮、黃芩素含量顯著提高[40]。 本研究中，T1 的吲哚類生物堿(靛藍(lán)和靛玉紅)、總黃酮含量均高于CK，說明在受到輕度化感脅迫時(shí)，可通過增加次生代謝產(chǎn)物含量的方式來提高菘藍(lán)對環(huán)境脅迫的適應(yīng)能力。 本研究還發(fā)現(xiàn)，隨著浸提液濃度的升高，T2、T3、T4 的靛玉紅含量均較T1 顯著降低，說明茶樹凋落葉中的化感物質(zhì)進(jìn)入菘藍(lán)體內(nèi)會影響其次生代謝途徑，進(jìn)而影響靛玉紅的合成。 T4 的靛玉紅、總黃酮含量較T2、T3 有上升趨勢，說明高濃度的化感物質(zhì)可在一定程度上刺激靛玉紅和總黃酮的積累，其原因可能是高濃度的化感物質(zhì)破壞了菘藍(lán)體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)，使得菘藍(lán)的抗氧化酶活性及其基因表達(dá)量降低。 菘藍(lán)通過增加黃酮和靛玉紅含量的方式來維持植物體內(nèi)活性氧的平衡，黃酮和靛玉紅是天然的非酶抗氧化劑，能夠與氧自由基直接發(fā)生反應(yīng)，從而清除自由基[41]，維持植株的正常生長，提高植株對化感脅迫的適應(yīng)能力。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，菘藍(lán)可通過滲透調(diào)節(jié)機(jī)制、抗氧化酶系統(tǒng)和非抗氧化酶系統(tǒng)的共同協(xié)作，以應(yīng)對茶樹凋落葉的化感作用，在低濃度化感物質(zhì)作用下，菘藍(lán)生長可能不會受到較大的影響，因此，在茶園種植菘藍(lán)時(shí)可通過調(diào)整種植密度、勤采茶葉、清理落葉等措施加強(qiáng)田間管理，減少茶樹化感物質(zhì)的產(chǎn)生，以創(chuàng)造有利于菘藍(lán)生長的環(huán)境條件。