楊林林，姜亞洲，劉尊雷，林 昱，凌建忠，李圣法

（中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200090）

耳石是真骨魚類生長過程中沉淀在內(nèi)耳中的一種鈣質(zhì)硬組織，其形態(tài)特征具有顯著的種間差異和物種特異性［1］。耳石形態(tài)分析可以定量地解釋魚類種間和群體間的差異，是物種鑒定和群體區(qū)分的一種重要工具，在魚類種間和種內(nèi)判別方面具有良好效果［2-4］。耳石形態(tài)學(xué)分析方法主要有可量性狀比較法［5］、橢圓傅里葉分析法［6-7］、耳石形態(tài)指標(biāo)法等［8］。同一物種的不同生態(tài)群體因受到各自生存環(huán)境的脅迫，在生長和發(fā)育方面存在一定差異，進(jìn)而影響耳石沉積，造成群體耳石形態(tài)的特異性。

藍(lán)點(diǎn)馬鮫（Scomberomorus niphonius）屬鱸形目（Perciformes）鯖科（Scombridae）馬鮫屬，是一種暖水性大型中上層經(jīng)濟(jì)魚類，廣泛分布于西北太平洋［9］，中國的渤海、黃海和東海是其重要產(chǎn)區(qū)，近年來的年漁獲量超過40萬t［10］。藍(lán)點(diǎn)馬鮫具有長距離洄游習(xí)性，每年在產(chǎn)卵場、索餌場和越冬場之間做季節(jié)性洄游。每年的4—6月，藍(lán)點(diǎn)馬鮫繁殖群體陸續(xù)從越冬場進(jìn)入河口、港灣、海島周圍等中國沿海的各個(gè)產(chǎn)卵場。分節(jié)特征和量度測定的形態(tài)學(xué)研究將中國沿海的藍(lán)點(diǎn)馬鮫劃分為黃渤海種群和東海種群［11-13］；線粒體DNA和COⅠ序列分析表明東、黃海群體之間沒有明顯的種群遺傳分化［14-15］；而核基因組多樣性數(shù)據(jù)（AFLP）分析則顯示東、黃海群體之間有顯著的地理種群分化［16］。藍(lán)點(diǎn)馬鮫經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高，是中國沿海流刺網(wǎng)和拖網(wǎng)作業(yè)的重要捕撈對(duì)象?？茖W(xué)判定中國沿海各產(chǎn)卵場藍(lán)點(diǎn)馬鮫繁殖群體的種群歸屬，實(shí)現(xiàn)資源的可持續(xù)利用，成為當(dāng)前研究的首要任務(wù)。本研究以2016—2018年4—6月在萊州灣、海州灣、呂四漁場、象山港、沙埕港等中國沿海藍(lán)點(diǎn)馬鮫主要產(chǎn)卵場采集的繁殖群體為研究對(duì)象，闡述了中國沿海藍(lán)點(diǎn)馬鮫繁殖群體耳石形態(tài)的特異性，探討了耳石形態(tài)在中國沿海藍(lán)點(diǎn)馬鮫種群判別方面的應(yīng)用，旨在豐富藍(lán)點(diǎn)馬鮫的漁業(yè)生物學(xué)研究，為中國沿海藍(lán)點(diǎn)馬鮫資源的合理利用和科學(xué)管理提供理論材料。

1 材料和方法

1.1 樣本獲取

藍(lán)點(diǎn)馬鮫樣本于2016—2018年每年的4—6月采集于萊州灣、海州灣、呂四漁場、象山港、沙埕港等產(chǎn)卵場，均為流刺網(wǎng)作業(yè)漁獲。樣本在冰鮮冷藏條件下帶回實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行生物學(xué)測定。生物學(xué)測定的內(nèi)容包括叉長（fork length，F(xiàn)L，精確到1 mm）、體質(zhì)量（body weight，BW，精確到 1 g）、性腺成熟度等。實(shí)驗(yàn)期間共獲得性腺成熟度Ⅳ期以上的藍(lán)點(diǎn)馬鮫性成熟個(gè)體322尾，叉長范圍在400～1 450 mm，體質(zhì)量范圍在640～8 220 g。生物學(xué)測定后摘取樣本的左、右矢耳石，清洗表面后保存于耳石盒中。共獲得完整的藍(lán)點(diǎn)馬鮫性成熟個(gè)體矢耳石301對(duì)。因藍(lán)點(diǎn)馬鮫繁殖群體左、右耳石形態(tài)及雌、雄個(gè)體耳石形態(tài)不存在顯著差異［17］，本研究統(tǒng)一采用左耳石，雌、雄樣本合并分析。

1.2 研究方法

1.2.1 耳石形態(tài)學(xué)測定

耳石超聲波清洗后在50℃烘箱中干燥12 h，然后置于室內(nèi)冷卻至恒重。耳石在電子天平上進(jìn)行稱重（精確到1 mg）。因藍(lán)點(diǎn)馬鮫耳石屬于曲面非對(duì)稱型耳石，耳石圖像采集因角度不同會(huì)產(chǎn)生誤差，本研究統(tǒng)一將耳石凸面向上、凹面向下置于解剖鏡（Nikon SMZ800，ACT-2）下拍攝二維輪廓圖形（圖1）。利用Image Pro-plus 6.0軟件分析耳石輪廓圖像，篩選出面積、周長、耳石長、耳石寬、幾何中心最長半徑、幾何中心最短半徑等6個(gè)尺寸參數(shù)，結(jié)合耳石質(zhì)量，計(jì)算得出環(huán)率、圓度、橢圓率、矩形趨近率、縱橫比、形態(tài)因子、半徑比和面密度等8個(gè)形狀指標(biāo)［18-19］。計(jì)算方法同文獻(xiàn)［17］。這8個(gè)形狀指標(biāo)在一定程度上可以消除耳石位置、大小等因素對(duì)分析結(jié)果的影響。

圖1 藍(lán)點(diǎn)馬鮫矢耳石形態(tài)照片F(xiàn)ig.1 Sagittal otolith of Scomberomorus niphonius

1.2.2 耳石年齡鑒定

在完成耳石二維輪廓采集后，將耳石磨片，置于Nikon SMZ800型顯微鏡下，透射光觀察可見明帶和暗帶相間的年輪。為避免年齡因素對(duì)藍(lán)點(diǎn)馬鮫耳石形態(tài)的影響，實(shí)驗(yàn)統(tǒng)一選取2齡的性成熟個(gè)體，共計(jì)242尾。根據(jù)采集海域的不同，將藍(lán)點(diǎn)馬鮫樣本分為5個(gè)繁殖群體組，分別為渤海的萊州灣組（G1）、黃海的海州灣組（G2）和呂四漁場組（G3）、東海的象山港組（G4）和沙埕港組（G5）。

1.2.3數(shù)據(jù)分析

將耳石形狀指標(biāo)平方根轉(zhuǎn)化及標(biāo)準(zhǔn)化后計(jì)算Bray-Curtis相似性系數(shù)構(gòu)建矩陣，利用非參數(shù)多維標(biāo)度（NMDS）排序技術(shù)分析藍(lán)點(diǎn)馬鮫不同繁殖群體組的耳石形態(tài)特征。脅強(qiáng)系數(shù)（Stress）為NMDS分析結(jié)果的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)Stress＜0.2時(shí)，說明可以用NMDS的二維點(diǎn)圖表示，且有一定的解釋意義［20］。

采用單因子相似性分析（ANOSIM）進(jìn)行不同繁殖群體組間耳石形態(tài)差異的顯著性檢驗(yàn)。運(yùn)用相似性百分比分析方法（SIMPER）分析造成繁殖群體內(nèi)相似性的耳石形態(tài)典型指標(biāo)以及造成繁殖群體間相異性的耳石形態(tài)分歧指標(biāo)，計(jì)算各形態(tài)指標(biāo)對(duì)不同繁殖群體組內(nèi)相似性和組間相異性的貢獻(xiàn)度。通過逐步判別函數(shù)分析（DFA）方法篩選測量指標(biāo)后建立判別函數(shù)，計(jì)算判別準(zhǔn)確率和綜合判別率。

統(tǒng)計(jì)分析主要通過SPSS 19、PRIMER 7.0等軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣本組成及耳石形態(tài)指標(biāo)

實(shí)驗(yàn)期間，獲得的 G1、G2、G3、G4、G5的樣本量分別為 54、46、38、72、32尾，平均叉長分別為（568.8±24.2）mm、（534.8±27.1）mm、（539.5±30.3）mm、（583.2±31.9）mm、（587.1±43.9）mm，平均體質(zhì)量分別為（1 462.3±440.2）g、（1 140.6±409.2）g、（1 268.5±403.4）g、（1 532.6±518.6）g和（1 554.1±566.2）g。5個(gè)繁殖群體組耳石形狀指標(biāo)的均值如表1所示。

2.2 耳石形態(tài)的差異性

ANOSIM分析結(jié)果顯示，5個(gè)藍(lán)點(diǎn)馬鮫繁殖群體的耳石形態(tài)存在顯著性差異（R＝0.105，P＝0.002）。對(duì)繁殖群體進(jìn)行兩兩比較后發(fā)現(xiàn)，G2和G3的耳石形態(tài)不存在顯著性差異（P＞0.05）；G4和G5的耳石形態(tài)不存在顯著性差異（P＞0.05），其他兩兩之間耳石形態(tài)的差異均達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）（表2）。

對(duì)藍(lán)點(diǎn)馬鮫繁殖群體的耳石形態(tài)數(shù)據(jù)進(jìn)行NMDS排序，結(jié)果顯示，脅強(qiáng)系數(shù)為0.12，這說明NMDS圖能較好地反映各年齡組間耳石形態(tài)的相似關(guān)系（圖2）。

2.3 耳石形態(tài)的相似性和相異性百分比

SIMPER分析結(jié)果顯示，G1、G2、G3、G4和G5組內(nèi)的平均相似性分別為98.56%、98.48%、98.27%、98.05%和98.26%。對(duì) G1組內(nèi)相似性貢獻(xiàn)較大的耳石形態(tài)指標(biāo)為半徑比、縱橫比、面密度、矩形趨近率、形態(tài)因子和圓度，累積相似性貢獻(xiàn)率為90.31%；對(duì)G2和G3組內(nèi)相似性貢獻(xiàn)率較大的耳石形態(tài)指標(biāo)為半徑比、縱橫比、面密度、矩形趨近率、形態(tài)因子、圓度和橢圓率，累積相似性貢獻(xiàn)率分別為97.49%和97.75%；對(duì)G4和G5組內(nèi)相似性貢獻(xiàn)率較大的耳石形態(tài)典型指標(biāo)為半徑比、縱橫比、面密度、矩形趨近率、形態(tài)因子和橢圓率，累積相似性貢獻(xiàn)率分別為90.24%和90.00%。半徑比、縱橫比、面密度和矩形趨近率是對(duì)各繁殖群體組內(nèi)相似性貢獻(xiàn)度較高的耳石形態(tài)典型指標(biāo)（表3）。

G1＆G2、G1＆G3、G1＆G4、G1＆G5、G2＆G3、G2＆G4、G2＆G5、G3＆G4、G3＆G5、G4＆G5組間的平均相異性分別為 2.79%、2.78%、2.23%、2.09%、1.61%、2.57%、2.19%、2.54%、2.17%、1.79%。各個(gè)繁殖群體組間相異性貢獻(xiàn)較大的耳石形態(tài)分歧指標(biāo)不盡相同，主要為面密度、形態(tài)因子和半徑比（表4）。各組間相異性貢獻(xiàn)百分比在一定程度上反映了藍(lán)點(diǎn)馬鮫不同繁殖群體耳石形態(tài)的特異性。

圖2 基于Bray-Curtis相似性系數(shù)的各繁殖群體耳石形態(tài)的NMDS排序Fig.2 NMDS results for otolith shape of different spawning populations based on Bray-Curtis sim ilarity

表1 不同繁殖群體的耳石形狀參數(shù)Tab.1 Shape indices of different spawning populations

表2 不同繁殖群體間耳石形態(tài)的相似性分析Tab.2 Analysis of sim ilarity test for the otolith shape of different spawning populations

表3 繁殖群體內(nèi)相似性累積貢獻(xiàn)率大于90%的耳石形態(tài)典型指標(biāo)Tab.3 Typifying shape indices w ith cumu lative contributionsm ore than 90%to the w ithin-group sim ilarity

表4 繁殖群體間相異性累積貢獻(xiàn)率大于90%的耳石形態(tài)分歧指標(biāo)Tab.4 Discrim ination shape indices w ith cum ulative contributionsmore than 90%to every two spawning populations dissim ilarity

2.4 耳石形態(tài)的判別分析

對(duì)5個(gè)藍(lán)點(diǎn)馬鮫繁殖群體的8個(gè)耳石形狀指標(biāo)進(jìn)行逐步判別分析，根據(jù)對(duì)模型的預(yù)測貢獻(xiàn)力逐步剔除不相關(guān)變量，結(jié)果7個(gè)變量納入判別分析，各繁殖群體的判別函數(shù)方程如下：

式中X1～X7分別代表耳石形態(tài)指標(biāo)環(huán)度、圓度、橢圓率、形態(tài)因子、縱橫比、半徑比、面密度。

采用交叉驗(yàn)證法對(duì)建立的判別函數(shù)進(jìn)行回判，結(jié)果顯示，判別準(zhǔn)確率在55.26%～92.59%，綜合判別正確率為71.07%。其中，G1的判別效果較好，僅有 4尾錯(cuò)判成 G4；而 G2有 8尾（17.39%）錯(cuò)判成 G3，G3有 17尾（44.74%）錯(cuò)判成 G2；G4有27尾（37.5%）錯(cuò)判成 G5，G5有10尾（31.25%）錯(cuò)判成 G4。G2和 G3、G4和 G5存在較大程度的相互誤判。

3 討論

3.1 耳石形態(tài)的群體差異

耳石形態(tài)特征主要受魚類個(gè)體自身的遺傳信息和所處環(huán)境因素的影響，而性別、年齡、生長等生理特征也能夠影響耳石發(fā)育及形態(tài)特征的形成［21-23］。已有的研究顯示，藍(lán)點(diǎn)馬鮫繁殖群體雌、雄個(gè)體的耳石形態(tài)不存在顯著差異，未達(dá)到雌雄二型水平，而不同年齡組的耳石形態(tài)則存在顯著差異［17］。本研究統(tǒng)一采用2齡的性成熟個(gè)體，在一定程度上避免了不同發(fā)育階段或年齡組的魚類個(gè)體因自身生理?xiàng)l件及生活履歷差異對(duì)耳石形態(tài)可能造成的影響。

對(duì)不同海域5個(gè)藍(lán)點(diǎn)馬鮫繁殖群體的耳石形態(tài)差異進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果表明，渤海、黃海、東海3個(gè)不同海區(qū)間的繁殖群體存在極顯著差異，而同一海區(qū)繁殖群體的差異并不顯著。這與黃海藍(lán)點(diǎn)馬鮫群體鑒別的研究結(jié)果一致［24］。半徑比、縱橫比、面密度和矩形趨近率對(duì)繁殖群體組內(nèi)的相似性貢獻(xiàn)度較高，而面密度、形態(tài)因子和半徑比對(duì)不同繁殖群體組間的相異性貢獻(xiàn)度較高。這些耳石形態(tài)指標(biāo)有大小變量，也有輪廓變量。這說明，不同海區(qū)之間藍(lán)點(diǎn)馬鮫繁殖群體的耳石在長寬、輪廓、厚薄等方面存在較大差異，這可能與海區(qū)之間的不同生境條件有關(guān)。有研究顯示，海流、水團(tuán)對(duì)上層魚類群體的空間分布、運(yùn)動(dòng)遷移和隔離起著重要作用［25-26］。渤海、黃海和東海擁有不同的海洋水文條件，由此帶來的不同溫鹽度可能直接或間接造成不同海區(qū)藍(lán)點(diǎn)馬鮫的耳石發(fā)育差別。此外，魚類的攝食活動(dòng)或營養(yǎng)條件也能影響耳石的沉積比率和形式，進(jìn)而造成耳石形態(tài)的差異［27-29］。中國沿海的藍(lán)點(diǎn)馬鮫存在多個(gè)越冬場及產(chǎn)卵場，產(chǎn)卵后即分散索餌［30］。不同海區(qū)的餌料豐富程度和組成不盡相同，這可能造成了不同海區(qū)藍(lán)點(diǎn)馬鮫的耳石在長寬、厚薄等形態(tài)方面的沉積差異。

表5 不同繁殖群體的逐步判別分析結(jié)果Tab.5 Results of stepw ise discrim inant analysis of spawning populations

3.2 基于耳石形態(tài)的群體判別

判別分析的結(jié)果顯示，渤海萊州灣藍(lán)點(diǎn)馬鮫繁殖群體的識(shí)別成功率最高，達(dá)到82.59%；黃海呂四漁場繁殖群體的識(shí)別成功率最低，僅為55.26%。黃海和東海群體的識(shí)別成功率較低是因?yàn)橄嗤^(qū)內(nèi)的群體誤判比例較高。如黃海的海州灣群體和呂四漁場群體存在較大比例相互誤判，而東海的象山港群體和沙埕港群體也存在同樣情況?？傮w上，通過耳石形態(tài)指標(biāo)可以有效地將渤海群體、黃海群體與東海群體區(qū)分開。渤海由于其半封閉的特性，海流及水團(tuán)的影響較弱，海洋水文條件不易受外部條件的影響，加之膠東半島的天然阻隔，極大限制了渤海群體與外界的交流，造成耳石形態(tài)的特異性較高，這可能是渤海群體耳石形態(tài)識(shí)別率較高的原因。黃海群體與東海群體因受不同海流或水團(tuán)的影響，環(huán)境和攝食條件差異較大，加之長江徑流的注入極大限制了藍(lán)點(diǎn)馬鮫群體的南北向移動(dòng)，因此群體在耳石形態(tài)方面存在一定差異和較大區(qū)分度。而黃海和東海的內(nèi)部群體因所處海洋水文條件和餌料條件近似，耳石形態(tài)的差異性較小，內(nèi)部交流也不存在障礙，因此識(shí)別成功率較低，進(jìn)而存在較大比例的相互誤判。

藍(lán)點(diǎn)馬鮫在中國沿海的產(chǎn)卵場眾多，種群結(jié)構(gòu)復(fù)雜，種群內(nèi)部甚至分化為不同的地理群系［15］。耳石形態(tài)分析的結(jié)果表明，渤海、黃海和東海藍(lán)點(diǎn)馬鮫繁殖群體的耳石形態(tài)差異顯著，存在較大的區(qū)分度，這與黃海、東海藍(lán)點(diǎn)馬鮫繁殖群體為2個(gè)種群的研究結(jié)果相一致［13］。有研究顯示，渤海與黃海的藍(lán)點(diǎn)馬鮫繁殖群體為同一種群［11］，本研究從耳石形態(tài)分析上顯示出兩者存在較大差別，ZHANG等［31］在一定體長范圍內(nèi)也得出了類似結(jié)果。盡管3個(gè)海區(qū)5個(gè)繁殖群體的地理隔離較遠(yuǎn)，但均有個(gè)體在海區(qū)間相互誤判。這說明中國沿海的藍(lán)點(diǎn)馬鮫種群可能存在小比例的個(gè)體交流和混合，這在標(biāo)記放流的研究結(jié)果中也有所反映［10，32］。還有一種可能的解釋是，部分個(gè)體經(jīng)歷的環(huán)境史類似致使耳石形態(tài)的群體間差異降低，群體判別的正確率下降。研究結(jié)果證明，耳石形態(tài)學(xué)分析方法可以簡單高效地區(qū)分魚類群體，但識(shí)別成功率和正確率受環(huán)境因素的影響較大。耳石微化學(xué)分析可以推演魚類生活史所處水域的環(huán)境狀況［33-35］，是一種進(jìn)行魚類種群劃分和鑒定的有效輔助手段。中國沿海藍(lán)點(diǎn)馬鮫的種群劃分，特別是渤海與黃海群體，還需要結(jié)合耳石微化學(xué)分析技術(shù)進(jìn)一步確認(rèn)。