王先桂，曾 丹，蒙煥妮

(1.茅臺(tái)學(xué)院，貴州 仁懷 564501； 2.貴州珍酒釀酒有限公司，貴州 遵義 563000； 3.關(guān)嶺布依族苗族自治縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，貴州 關(guān)嶺 561300)

吡蟲(chóng)啉屬于新煙堿類(lèi)殺蟲(chóng)劑，該類(lèi)藥物具有殺蟲(chóng)譜廣、用量低、內(nèi)吸傳導(dǎo)性好、作用機(jī)制新穎和環(huán)境相容性高等特點(diǎn)，被廣泛用于水果蔬菜種植過(guò)程中[1]，可高效殺滅對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥等傳統(tǒng)殺蟲(chóng)劑有抗藥性的害蟲(chóng)，該藥持久期長(zhǎng)，對(duì)人類(lèi)和哺乳動(dòng)物會(huì)產(chǎn)生慢性毒理效應(yīng)和一定的神經(jīng)毒性[2]，0.05 mg/kg的吡蟲(chóng)啉就會(huì)損害人體淋巴細(xì)胞的遺傳物質(zhì)DNA[3-5]，在20℃條件下吡蟲(chóng)啉在水中溶解度達(dá)0.61 g/L[6]。近年來(lái)，隨著吡蟲(chóng)啉在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上使用量逐漸增加，其在農(nóng)產(chǎn)品上的殘留量越來(lái)越受到關(guān)注。

吡蟲(chóng)啉是極性化合物，具有熱不穩(wěn)定性的特點(diǎn)，適用于使用液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行分析檢測(cè)，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)是檢測(cè)吡蟲(chóng)啉的有效技術(shù)，但液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用設(shè)備昂貴，普及難度較大，結(jié)合縣級(jí)農(nóng)檢機(jī)構(gòu)的設(shè)備配置現(xiàn)狀，一般選用高效液相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)[7-9]。目前在實(shí)際工作中，按照現(xiàn)行有效的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 23379-2009對(duì)蔬菜中吡蟲(chóng)啉進(jìn)行測(cè)定時(shí)發(fā)現(xiàn)按照標(biāo)準(zhǔn)操作得到的回收率較低，通過(guò)對(duì)操作過(guò)程的優(yōu)化后可得到較好的回收率。因此，筆者就改良優(yōu)化后的操作技術(shù)介紹如下，以供吡蟲(chóng)啉檢測(cè)者參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料 白菜樣品于菜市場(chǎng)上隨機(jī)購(gòu)買(mǎi)。

1.1.2 試劑 農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品吡蟲(chóng)啉(純度≥99.0%)來(lái)自德國(guó)Dr.Ehrenstorfer GmbH公司，固相萃取柱(C18,200 mg，3 mL)來(lái)自博納艾杰爾科技公司，乙腈(色譜純)來(lái)自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司，氯化鈉、磷酸均為分析純，有機(jī)濾膜(孔徑0.45 μm)來(lái)自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀為美國(guó)Agilent HPLC 1260-VWD；液相色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；食品攪拌機(jī)為博朗(Braun)FP3010；勻漿機(jī)為德國(guó)IKA T10 高速組織勻漿機(jī)；分析天平ME204E購(gòu)自瑞士METTLER TOLEDO；離心機(jī)3K15購(gòu)自德國(guó)SIGMA；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-52AA購(gòu)自北京科偉永興儀器有限公司；循環(huán)水式真空泵SHB-Ⅲ，北京科偉永興儀器有限公司；超聲波清洗機(jī)SB-800DT，寧波新芝生物科技股份有限公司；超純水機(jī)WP-UP-WF-20購(gòu)自四川沃特爾處理設(shè)備有限公司。

1.3 吡蟲(chóng)啉標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.3.1 吡蟲(chóng)啉標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液 稱(chēng)取10 mg左右(精確到0.10 mg)吡蟲(chóng)啉標(biāo)準(zhǔn)品置于10 mL的容量瓶中，加乙腈溶解定容，如果溶解不徹底可超聲溶解，配制成1 000 μg/mL左右吡蟲(chóng)啉標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-18℃冰箱避光保存。

1.3.2 吡蟲(chóng)啉標(biāo)準(zhǔn)工作液 根據(jù)檢測(cè)工作的需要配制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，4℃避光保存。

1.4 蔬菜樣品的制備

將市場(chǎng)上隨機(jī)購(gòu)買(mǎi)的白菜樣品切碎，用食品攪拌機(jī)打碎均勻，備用；稱(chēng)取10 g白菜樣品于100 mL離心管中，添加吡蟲(chóng)啉標(biāo)準(zhǔn)液用于添加回收試驗(yàn)，同時(shí)也準(zhǔn)備空白樣品。

1.5 樣品前處理

1.5.1 提取 樣品分別加入20 mL乙腈，用高速勻漿機(jī)勻漿提取1 min，加入5 g氯化鈉，再勻漿提取1 min，將離心管放入離心機(jī)，在4 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心5 min，取上清液10 mL移入50 mL梨形瓶中，38℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干狀態(tài)，加入5%乙腈2 mL至梨形瓶中，超聲溶解并混勻梨形瓶?jī)?nèi)溶液，待凈化。

1.5.2 凈化 將固相萃取柱放置在固相萃取裝置或柱架上，加樣前用5 mL 5%乙腈平衡柱子，待液面即將到達(dá)固相萃取柱填料上方時(shí)，從上述梨形瓶中移取1 mL旋蒸后溶解的溶液至固相萃取柱上，控制3 s/滴左右的速度使溶液流經(jīng)萃取柱，待無(wú)液滴滴下時(shí)用5 mL水洗柱，棄去并抽干柱子，最后用1 mL 40%乙腈緩慢洗脫并擠干柱子，收集洗脫液，用0.45 μm的有機(jī)濾膜過(guò)濾洗脫液，待測(cè)。

1.6 色譜條件

采用液相色譜柱等度洗脫方式，流動(dòng)相A為0.1%磷酸水溶液，流動(dòng)相B為乙腈，流動(dòng)相比例A∶B=75∶25，無(wú)后運(yùn)行時(shí)間。柱溫30℃，進(jìn)樣量20 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm。

1.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將吡蟲(chóng)啉標(biāo)準(zhǔn)工作液用30%乙腈稀釋成質(zhì)量濃度分別為5.00 μg/mL、2.50 μg/mL、1.00 μg/mL、0.50 μg/mL、0.25 μg/mL、0.10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，與空白樣品和添加回收試驗(yàn)樣品共建序列進(jìn)樣。用脫機(jī)軟件分析，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.8 回收率與精密度試驗(yàn)

在白菜樣品中添加0.1 mg/kg、0.5 mg/kg、1.0 mg/kg 3個(gè)水平的吡蟲(chóng)啉，按照優(yōu)化后的方法進(jìn)行樣品前處理，每個(gè)水平重復(fù)6次，計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性范圍

經(jīng)檢測(cè),標(biāo)準(zhǔn)曲線在0.10～5.00 μg/mL內(nèi)，吡蟲(chóng)啉在液相色譜中的響應(yīng)值與質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，線性方程為y=49.102 1x-1.873 5，R=0.999 8。

2.2 色譜條件的選擇

通過(guò)可變波長(zhǎng)掃描檢測(cè)器掃描波長(zhǎng)最終確定吡蟲(chóng)啉的最大吸收波長(zhǎng)值為270 nm，因此選取270 nm的波長(zhǎng)用于吡蟲(chóng)啉的檢測(cè)。經(jīng)過(guò)分離洗脫，吡蟲(chóng)啉峰形對(duì)稱(chēng)，無(wú)拖尾現(xiàn)象，確定為吡蟲(chóng)啉檢測(cè)的色譜條件。以此條件進(jìn)行吡蟲(chóng)啉標(biāo)準(zhǔn)溶液(圖1)、白菜樣品中加吡蟲(chóng)啉(圖2)、白菜樣品空白(圖3)色譜圖的繪制。

2.3 前處理優(yōu)化

將提取步驟中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干后加入到梨形瓶中的溶液由25%乙腈優(yōu)化為5%乙腈，將凈化步驟中用于平衡萃取柱的溶液由25%乙腈優(yōu)化為5%乙腈，將洗脫液由乙腈優(yōu)化為40%乙腈，由此得到優(yōu)化前后吡蟲(chóng)啉回收率平均值由48.6%提至95.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差由4.3%降至3.8%。說(shuō)明優(yōu)化后回收率遠(yuǎn)高于優(yōu)化前的回收率，且優(yōu)化后的回收率達(dá)到了檢測(cè)的準(zhǔn)確度要求，說(shuō)明前處理步驟優(yōu)化效果良好。

2.5 回收率與精密度

經(jīng)計(jì)算,樣品中添加0.1 mg/kg、0.5 mg/kg、1.0 mg/kg 3個(gè)水平的吡蟲(chóng)啉，吡蟲(chóng)啉的回收率為89.2%～101.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.9%～4.5%，符合農(nóng)藥殘留分析對(duì)回收率的要求。表明，前處理優(yōu)化后吡蟲(chóng)啉的回收率更高，且重復(fù)性更好。

2.6 檢測(cè)限與定量限

根據(jù)利用信噪比的倍數(shù)與檢測(cè)限和定量限之間的關(guān)系得到優(yōu)化后的吡蟲(chóng)啉LOD為0.003 mg/kg，LOQ為0.010 mg/kg。

3 結(jié)論

將前處理步驟中25%乙腈優(yōu)化為5%乙腈，避免了固相萃取柱的“穿漏”現(xiàn)象。由于乙腈是強(qiáng)極性的有機(jī)溶液，用乙腈或乙腈與水的混合液對(duì)萃取柱上的吡蟲(chóng)啉進(jìn)行洗脫，當(dāng)選用25%乙腈作為旋蒸瓶溶解液和萃取柱的平衡液時(shí)，其溶液極性偏大，導(dǎo)致殘留在柱上的平衡液和上樣液的乙腈比例偏大，在過(guò)柱時(shí)易將吡蟲(chóng)啉從柱上帶下來(lái)，這就是萃取柱的“穿漏”現(xiàn)象。當(dāng)降低為5%乙腈時(shí)，其極性無(wú)法將吡蟲(chóng)啉從萃取柱上帶下來(lái)，使得吡蟲(chóng)啉留在了柱床上，選用40%乙腈作為洗脫液，其極性可以順利的將萃取柱上的吡蟲(chóng)啉洗脫下來(lái)，從而吡蟲(chóng)啉的回收率達(dá)到檢測(cè)要求。洗脫液40%乙腈的比例也更接近于流動(dòng)相的比例，使得樣液進(jìn)入液相色譜系統(tǒng)后與流動(dòng)相更加契合，峰形等效果基本不受影響。試驗(yàn)優(yōu)化了前處理步驟中互溶液、平衡液和洗脫液的乙腈比例，確立了吡蟲(chóng)啉的高效液相色譜檢測(cè)方法。優(yōu)化后的方法所用儀器設(shè)備無(wú)變化，儀器無(wú)后運(yùn)行時(shí)間，方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果準(zhǔn)確穩(wěn)定可靠。該方法在各類(lèi)型蔬菜和水果中均可應(yīng)用。