王曉星，易慕華，方捷迪，李爭艷，曹春雨

免疫組化是通過抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的呈色反應(yīng)，利用帶顯色劑標記的特異性抗體(或抗原)對組織細胞內(nèi)相應(yīng)的抗原(或抗體)進行定性、定位、定量檢測的一項技術(shù)[1-2]，是病理科最常用的確診疾病和診斷疑難病例的一種輔助檢測手段[3-4]。免疫組化操作步驟包括抗原修復(fù)、抗體孵育、DAB顯色、蘇木精復(fù)染、分化、返藍等[5-7]，每一步都會影響切片的評片等級(如優(yōu)秀、良好、合格及不合格)，良好及以上的評片標準中不僅要求抗原定位準確、陽性著色與背景對比顯著，還要求蘇木精復(fù)染適度。我科參加湖北省病理科醫(yī)療質(zhì)量控制中心舉辦的全省免疫組化室間測評活動成績合格，專家組發(fā)現(xiàn)本科的免疫組化雖染色強度不錯，但復(fù)染效果差。我科針對這一問題，及時邀請專家現(xiàn)場指導(dǎo)，蘇木精染色在酸性條件下呈棕色，在堿性條件下呈藍色，蘇木精過染深分化后的返藍尤為重要，同時將堿性抗原修復(fù)液EDTA用于細胞核返藍，可重復(fù)性高，適用范圍廣，故迫切將EDTA的新用途向病理同仁進行匯報。本實驗將病理科常用的幾種返藍液用于細胞核的藍化，了解不同返藍液的返藍效果，重點評價非常規(guī)使用的EDTA作為返藍液對陰性細胞核返藍后的顏色和穩(wěn)定性，現(xiàn)介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料隨機選取三峽大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院2017年1～12月存檔的石蠟標本20例，復(fù)習(xí)完整的臨床資料，所有患者術(shù)前均未行放、化療等其他治療，標本前期處理一致，均經(jīng)規(guī)范化取材、10%中性福爾馬林固定、常規(guī)組織脫水、透明、浸蠟、包埋及制片。每個標本按免疫組化染色要求連續(xù)切6張切片，分為6組，每組20張(即20例)。

1.2 儀器與試劑隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(HENGZI，上海躍進公司)。即用型鼠抗人Ki-67核抗原單克隆抗體(Catalog#0077)購自DAKO公司，顯色系統(tǒng)購自DAKO公司。碳酸鋰粉末(BASO公司)、濃氨水(西隴化工公司)及EDTA液體試劑(DAKO公司)經(jīng)購買后在實驗室或科內(nèi)按要求自行配制。飽和碳酸鋰溶液：碳酸鋰粉末溶解于1 000 mL蒸餾水中，pH約9.0；0.3%氨水：將3 mL濃氨水溶解于1 000 mL蒸餾水中，pH約9.0；EDTA溶液：將EDTA原液用蒸餾水稀釋50倍待用，室溫下EDTA溶液pH約8.0，50 ℃時pH約8.5。

1.3 方法免疫組化染色采用EnVision兩步法：3 μm厚連續(xù)切片，依次將石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化，EDTA(pH 9.0)對組織抗原進行高壓修復(fù)，3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，滴加一抗Ki-67，37 ℃孵育60 min；取出切片，滴加二抗，37 ℃孵育30 min；DAB顯色10 min，蘇木精復(fù)染6 min、分化20 s、返藍2 min、脫水、透明和封固。返藍試劑分別為飽和碳酸鋰(pH 9.0)、0.3%氨水(pH 9.0)、室溫EDTA(pH 8.0)、加熱EDTA(pH 8.5)、流動自來水(pH 7.0)及溫水(pH 7.2)，以上返藍試劑室溫為(15±2) ℃，加熱溫度為(50±2) ℃。

1.4 結(jié)果判定Ki-67陽性信號位于細胞核，優(yōu)質(zhì)的免疫組化切片標準是復(fù)染適宜，染色清晰，著色恰當(dāng)，陰性與陽性部位藍棕相映，對比分明，透明度高。

2 結(jié)果

基于組織前處理及免疫組化染色方法相對一致前提下，蘇木精復(fù)染后最佳返藍液是以得到最適陰性細胞核藍染及最佳陽性和陰性棕藍對比為標準。本實驗分別選取飽和碳酸鋰、0.3%氨水、加熱EDTA(約50 ℃)、室溫EDTA、溫水、流動自來水共6種溶液作為返藍液，同批次染色分別作用于標本來源相同的免疫組化切片，即該實驗僅返藍液不同，其它條件完全相同，本實驗中20例切片在不同返藍液作用下均可返藍，現(xiàn)以其中1例乳腺癌標本進行詳細闡述。

免疫組化切片返藍效果顯示6種返藍液均具有返藍作用，但返藍結(jié)果不一致，其中流動自來水(圖1A)處理后，胞核呈藍黑色，組織切片對比度及透明度均差，間接影響免疫組化的結(jié)果判讀；而經(jīng)加熱EDTA(約50 ℃)返藍后(圖1B)切片復(fù)染適合，著色適度，透明度好，陰性部位與陽性部位藍棕相映，對比鮮明，但部分區(qū)域陰性核較灰暗；切片經(jīng)室溫EDTA(圖1C)或溫水(圖1D)處理后，陰性細胞核顯藍紫色；而飽和碳酸鋰(圖1E)及0.3%氨水(圖1F)返藍后，細胞核呈紫色。結(jié)果表明，加熱EDTA(約50 ℃)、室溫EDTA與其它四種返藍液效果相仿，作為抗原修復(fù)液的EDTA獲得新的應(yīng)用，可考慮作為返藍液。

圖1 使用不同返藍液返藍顯示乳腺癌中Ki-67的表達，EnVision兩步法：A.流動自來水(pH 7.0)；B.加熱EDTA(約50 ℃，pH 8.5)；C.室溫EDTA(pH 8.0)；D.溫水(pH 7.2)；E.飽和碳酸鋰(pH 9.0)；F.0.3%氨水(pH 9.0)

3 討論

本實驗通過查閱資料并結(jié)合國內(nèi)病理科技術(shù)發(fā)展現(xiàn)狀，選擇病理科普遍使用的6種返藍液，即飽和碳酸鋰[8]、0.3%氨水[9]、EDTA(室溫)、EDTA(50 ℃)、流動自來水及溫水(50 ℃)，以上試劑具有經(jīng)濟實惠、方便實用、使用廣泛和高效性。以湖北省為例，流動自來水不同縣市的水質(zhì)及pH存在顯著差異，當(dāng)該地區(qū)流動自來水質(zhì)偏酸性則會使細胞核經(jīng)蘇木精復(fù)染再返藍后細胞核偏紅或棕，返藍效果不佳，直接影響免疫組化切片的染色效果與切片優(yōu)良率，為達到優(yōu)良評價等級，技術(shù)員常通過調(diào)節(jié)流動自來水的溫度或沖洗時間來達到最佳返藍效果，但有時會出現(xiàn)制片時間過長或因不同技術(shù)員間出現(xiàn)個體差異。本實驗以其中1例乳腺癌標本進行實驗，結(jié)果顯示6種返藍試劑均具有返藍作用，加熱EDTA(約50 ℃)或室溫EDTA與飽和碳酸鋰、0.3%氨水、流動自來水及溫水(50 ℃)效果相當(dāng)，可考慮將抗原修復(fù)液EDTA用作返藍液。

EDTA可作為返藍液的原因：(1)EDTA是堿性試劑，EDTA的返藍原理和其他返藍液一樣，均是使蘇木精復(fù)染后的細胞核在堿性條件下呈現(xiàn)藍色。(2)溶液溫度對pH存在一定的影響，通常溫度升高，溶液電解質(zhì)電離越強，電離出更多的氫氧根離子，溶液的pH升高。實驗中室溫EDTA的pH約8.0，加熱EDTA的pH 8.5，流動自來水pH 7.0，溫水pH 7.2，加熱后的返藍液pH變大，這一結(jié)果與溫度的改變引起溶液pH改變理論相一致。(3)與其它pH不同的返藍試劑相比，pH為8.0～8.5的環(huán)境下也適合細胞核的藍化。(4)作為組織修復(fù)的EDTA試劑中含有脫蠟劑，增加切片的透明度，促使細胞核的藍色更鮮艷。所以，EDTA不僅可用于免疫組化中的組織抗原修復(fù)，還可以再加熱作為后續(xù)的返藍試劑用于臨床及科研中對細胞核的藍化，保證返藍液的新鮮與酸堿度，在節(jié)約成本的同時，使免疫組化切片染色達到免疫組化室間質(zhì)量控制標準，但其返藍的缺陷暫未發(fā)現(xiàn)。