夏 丹

胃癌是全球范圍內(nèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其在東亞國(guó)家尤其是在中國(guó)發(fā)病率最高。胃癌是國(guó)內(nèi)第三大腫瘤相關(guān)性死亡的主要原因[1]。MARCH2(membrane associated RING-CH protein 2)是MARCH家族的成員之一，含RING結(jié)構(gòu)域，作為E3泛素連接酶，可調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)輸、DNA修復(fù)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種細(xì)胞活動(dòng)。近年有文獻(xiàn)報(bào)道MARCH2與病毒免疫逃逸蛋白密切相關(guān)，HIV-1感染時(shí)MARCH2表達(dá)水平升高[2]。MARCH2的泛素化底物包括Dsh[3]、CFTR[4]、β2AR[5]和DLG1[6]，其在腫瘤中的作用鮮有報(bào)道。本文應(yīng)用免疫組化SP法檢測(cè)MARCH2在125例胃癌組織中的表達(dá)，并探討MARCH2表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料選取2000年1月～2016年12月山東醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校附屬醫(yī)院和北京大學(xué)第三醫(yī)院存檔的原發(fā)性胃癌手術(shù)切除標(biāo)本125例及正常胃黏膜組織標(biāo)本30例。其中男性96例，女性29例，中位年齡60歲(33～82歲)，所有患者術(shù)前均未行化療、放療及生物治療。病理診斷及組織學(xué)分級(jí)均由兩名病理醫(yī)師確診。所選病例臨床資料完整，其中高分化腺癌1例，中分化腺癌28例，低分化腺癌96例；TNM分期：Ⅰ期11例，Ⅱ期26例，Ⅲ期76例，Ⅳ期12例；85例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片6張備用。收集患者的臨床病理資料，包括患者性別、年齡、腫瘤大小、分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期(UICC/AJCC 2010)。

1.2 試劑兔抗人MARCH2多克隆抗體(美國(guó)Abcam公司)；濃縮型DAB試劑盒(北京中杉金橋公司)、SP免疫組化超敏染色試劑盒(福州邁新公司)。

1.3 方法采用免疫組化SP法染色，抗原修復(fù)為高壓熱修復(fù)，修復(fù)液使用1 mmol/L EDTA(pH 9.0)，一抗為MARCH2(1 ∶100)，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，DAB顯色。用已知MARCH2陽(yáng)性片作為陽(yáng)性對(duì)照，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定由兩位病理醫(yī)師獨(dú)立閱片綜合判斷。每張切片隨機(jī)觀察5個(gè)有代表意義的高倍視野，每個(gè)高倍視野計(jì)數(shù)150～200個(gè)細(xì)胞，蛋白表達(dá)采用免疫反應(yīng)評(píng)分(immunoreactivity score, IRS)，將著色細(xì)胞數(shù)比例與著色強(qiáng)度相結(jié)合。按著色細(xì)胞占計(jì)數(shù)細(xì)胞百分率計(jì)分：≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。按著色強(qiáng)度計(jì)分：未著色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕色為3分。將兩項(xiàng)得分結(jié)果相乘：0分為陰性(-)；1～4分為弱陽(yáng)性(+)；5～8分為中等陽(yáng)性()；9～12分為強(qiáng)陽(yáng)性()。如果兩名病理醫(yī)師評(píng)分差異>3分，則該標(biāo)本需重新評(píng)分。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，兩變量之間的相關(guān)性采用Spearman等級(jí)相關(guān)性分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MARCH2在胃癌組織中的表達(dá)MARCH2染色主要位于腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)和(或)胞核，呈彌漫棕色顆粒狀(圖1)。125例胃癌組織中MARCH2陰性34例，弱陽(yáng)性21例，中度陽(yáng)性53例，強(qiáng)陽(yáng)性17例。MARCH2在胃癌組織中的陽(yáng)性率為72.8%(91/125)。30例正常胃黏膜組織中MARCH2陰性23例，弱陽(yáng)性7例。MARCH2在正常胃黏膜組織中的陽(yáng)性率為23.3%(7/30)。MARCH2在胃癌組織中的陽(yáng)性率明顯高于正常胃黏膜組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，表1)。

2.2 MARCH2表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系MARCH2表達(dá)與胃癌分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期密切相關(guān)(P<0.01，表2)。MARCH2表達(dá)與患者年齡、性別和腫瘤直徑無(wú)關(guān)。

圖1 MARCH2在胃癌組織中的表達(dá)，SP法：A.MARCH2陰性；B.MARCH2弱陽(yáng)性；C.MARCH2中度陽(yáng)性；D.MARCH2強(qiáng)陽(yáng)性

表1 胃癌及正常胃黏膜組織中MARCH2的表達(dá)

表2 MARCH2表達(dá)與胃癌臨床病理特征的相關(guān)性

3 討論

MARCH家族是一個(gè)結(jié)構(gòu)上相關(guān)聯(lián)的蛋白家族，其成員結(jié)構(gòu)特點(diǎn)為由N端的RING-CH結(jié)構(gòu)域和緊連的C端兩個(gè)或多個(gè)跨膜區(qū)組成，這種跨膜RING-CH finger蛋白具有多種生物學(xué)功能，如免疫調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)控和膜運(yùn)輸[7]。

目前MARCH家族有11個(gè)成員(MARCH-I-XI)[8]。MARCH-Ⅱ基因是Bartee課題組在2004年發(fā)現(xiàn)，定位于第19號(hào)染色體短臂13區(qū)2帶(19p13.2)，基因全長(zhǎng)25 746 bp，其開(kāi)放讀碼框編碼246個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量為2.6×104。TMHMM軟件分析和功能結(jié)構(gòu)域分析顯示MARCH-Ⅱ是二次跨膜蛋白，由N端RING domain、中間的二次跨膜區(qū)和C端的PDZ domain構(gòu)成。功能研究顯示，MARCH-Ⅱ能降解細(xì)胞表面受體如轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TfR)和共刺激分子B7.2(CD86)[7]。應(yīng)用免疫熒光觀察到MARCH蛋白與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以及溶酶體共定位[7]。Xavier研究團(tuán)隊(duì)在HEK293T細(xì)胞中證實(shí)MARCH-Ⅱ也能定位在細(xì)胞膜上，通過(guò)其PDZ motif與DLG1相互作用促進(jìn)DLG1泛素化，減弱DLG1在細(xì)胞連接點(diǎn)的表達(dá)，影響細(xì)胞的極性[9]。Shenoy課題組證實(shí)MARCH-Ⅱ能與β2AR相互作用，β2AR拮抗劑卡維地洛能夠增強(qiáng)MARCH-Ⅱ與β2AR相互作用促進(jìn)β2AR的內(nèi)吞和溶酶體降解。MARCH-Ⅱ也能促進(jìn)β2AR的泛素化，調(diào)節(jié)細(xì)胞表面的β2AR水平[5]。最近Guggino科研團(tuán)隊(duì)研究發(fā)現(xiàn)，在囊性纖維化支氣管上皮細(xì)胞中MARCH-Ⅱ通過(guò)與CAL(CFTR相關(guān)的配體)和STX6結(jié)合泛素化并降解CFTR[4]。CFTR是質(zhì)膜cAMP調(diào)節(jié)的Cl-通道，負(fù)責(zé)經(jīng)上皮的鹽和液體的運(yùn)輸。CFTR基因功能缺失性突變會(huì)引起致死性退行性基因遺傳病囊性纖維化(cystic fibrosis, CF)[10]。已有研究顯示，CFTR缺陷會(huì)引起自噬的減低，導(dǎo)致蛋白聚集體的積累、肺部炎癥和CF的發(fā)生。累積的數(shù)據(jù)顯示，CFTR在腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。根據(jù)腫瘤類(lèi)型不同，CFTR遺傳變異可能增高或降低腫瘤發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[11-13]。目前研究尚不能確定在腫瘤細(xì)胞中CFTR和自噬之間的關(guān)系，且CFTR與MARCH2在自噬中的功能關(guān)系尚不清楚。

本組先前實(shí)驗(yàn)證實(shí)了MARCH2負(fù)向調(diào)控細(xì)胞自噬[14]；MARCH2過(guò)表達(dá)會(huì)損傷自噬，表現(xiàn)為過(guò)表達(dá)MARCH2導(dǎo)致LC3B-Ⅱ水平的減少和內(nèi)外源性自噬性底物降解的減弱，該效應(yīng)的發(fā)揮一方面牽涉PIK3CA/AKT-MTOR信號(hào)通路的活化，另一方面可能是通過(guò)與CFTR相互作用，促進(jìn)其功能失活而實(shí)現(xiàn)的[14]。然而，MARCH2在腫瘤中的作用并不清楚。

本實(shí)驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)了自噬負(fù)向調(diào)節(jié)因子MARCH2在125例胃癌中的表達(dá)并且評(píng)估了MARCH2表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MARCH2在胃癌中的表達(dá)水平明顯高于正常胃黏膜組織，提示MARCH2可能參與癌癥的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦顯示，MARCH2陽(yáng)性染色更多出現(xiàn)在浸潤(rùn)深度更深、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或更高TNM分期的胃癌組織中，提示MARCH2可能在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮作用。這些結(jié)果提示MARCH2參與了胃癌的發(fā)生、發(fā)展，MARCH2可能成為胃癌診斷、治療和評(píng)估預(yù)后的分子靶標(biāo)。