王雨方 李鶴群

(國家知識產權局專利局專利審查協作天津中心，天津 300300)

一、引言

1.1 埃博拉病毒

埃博拉病毒屬于絲狀病毒科(Filoviridae)，在電子顯微鏡下呈纖維狀“U”、“6”字形纏繞、成環(huán)或分枝，病毒粒子的長度一般在800納米左右，不過有部分種類的長度可達1000納米甚至更高[1]。該科有兩個重要的屬即馬爾堡病病毒屬(Marburgvirus)和埃博拉病毒屬(Ebolavirus)。馬爾堡病毒被分成單獨的一類，而埃博拉病毒(圖1)目前為止至少可以分為5亞型，分別是扎伊爾埃博拉病毒(1976)、蘇丹埃博拉病毒(1976)、雷斯頓埃博拉病毒(1989)、科特迪瓦埃博拉病毒(1994)和本迪布焦埃博拉病毒(2007)，其中扎伊爾型、蘇丹型和本迪布焦型對人類有高度致病性，科特迪瓦型因記載只有一位感染者而且康復所以沒有計算致病性，雷斯頓型對人無致病性。馬爾堡病毒的形態(tài)結構與埃博拉幾乎一樣，但是兩者的抗原抗體反應不同，作為一種結構相近的病毒，通常將他們放在一起研究[1-4]。

圖1 埃博拉病毒結構(最外層的“病毒包膜”是一種脂質雙層結構)

1.2 埃博拉病毒疫苗

埃博拉病毒發(fā)現至今已經38年，然而仍然沒有有效疫苗上市。每次疫情暴發(fā)之后關于抗埃博拉藥物和疫苗的研究才引起人們的重視。以前大部分疫苗研究僅僅停留在動物試驗階段，最前沿的是非人類靈長類動物實驗。2014年西非疫情大暴發(fā)后，世界各國都投入大量經費、集結大批科研人員展開了對埃博拉疫苗和藥物的研究。在疫苗研究方面，美國和加拿大率先研發(fā)的疫苗已經應用于臨床，在其他國家包括中國相關研究也取得了階段性進展。

為了研究埃博拉疫苗的專利技術的發(fā)展情況，結合實際審查工作經驗，筆者通過較為準確的關鍵詞，充分使用追蹤檢索、塊檢索、轉庫檢索等檢索策略，結合算符命令以確保檢索的全面性以及準確性，獲取初步檢索結果，依次瀏覽將明顯噪音專利剔除，得到標準樣本后，利用S系統的統計命令、Incopat專利分析數據庫和Excel對該領域的全球專利申請數據和中國專利申請數據進行統計分析。本次專利分析以關鍵詞和IPC分類號為主，對EBOV疫苗相關分類號的檢索范圍進行檢索，檢索關鍵詞為：“埃博拉”(伊波拉、依波拉、埃波拉)，Ebola，EBOV，疫苗；分類號為A61K39+，檢索數據包括截止到2019年05月14日公開的專利申請。

對獲得的數據進行分析，本文主要在專利宏觀分析后對專利技術發(fā)展脈絡進行了進一步分析，得出目前針對EBOV的專利的關注技術點。

二、技術發(fā)展脈絡分析

疫苗的接種為傳染病常規(guī)的防控手段，但目前沒有上市的埃博拉病毒疫苗，其原因是該病發(fā)病稀少且受地域局限，研發(fā)疫苗缺少經濟價值而無法引起疫苗研發(fā)企業(yè)的重視。但多個實驗室已在前期研究中取得了較好的進展，尤其在非人靈長類動物上可以獲得快速、有效的保護，為此次防控奠定了基礎。世界各地的科學家們采用多種途徑進行埃博拉病毒疫苗的研發(fā)，其中包括滅活疫苗、反向遺傳改造的復制缺陷型疫苗、病毒樣顆粒疫苗、牛痘病毒載體疫苗、人3型副流感病毒載體疫苗、新城疫載體疫苗、狂犬病毒載體疫苗、委內瑞拉馬腦炎病毒載體疫苗、DNA疫苗、水皰性口炎病毒載體疫苗、腺病毒載體疫苗。其中DNA疫苗和人5型腺病毒載體(rAd5)疫苗已完成了Ⅰ期臨床試驗證明了其安全性，但尚存一些不足需要完善。

2.1 埃博拉疫苗的分類技術發(fā)展脈絡分析

根據埃博拉疫苗的抗原表位的制備分類，主要分為基因工程亞單位疫苗、合成肽疫苗、核酸疫苗、活載體疫苗。本文就基因工程亞單位疫苗這個技術分支進行技術發(fā)展脈絡分析，其總體技術發(fā)展脈絡圖如圖2所示。

圖2 埃博拉疫苗技術發(fā)展脈絡

根據上文所述埃博拉疫苗的抗原表位的制備分類分別就上述兩個技術分支進行重點專利詳述，其中重點專利的總體分布狀況如表1所示。

表1 埃博拉病毒基因工程亞單位疫苗重點專利總體分布

2.2 基因工程亞單位疫苗

2.2.1 病毒樣顆粒(VLP)

GROGAN CASE C等人于2002年1月31日在美國申請的公開號為US20030108560A1號專利公開了一種生產嵌合絲病毒GP蛋白的方法，包含gp1和gp2的嵌合絲狀病毒gp蛋白，其中所述gp1選自與gp2不同的絲狀病毒。GP1來自埃博拉，GP2來自馬爾堡。所述嵌合GP是在SEQ ID NO：2及其保守取代物中鑒定的EBGP1/MBGP2。嵌合GP是在SEQ ID NO：8中鑒定的RVNGP1/MUSGP2及其保守取代物。

LI LIMIN于2003年10月1日在美國申請公開號為US20040223972A1的專利，其公開了一種抗體結合的N-末端或C-末端區(qū)域的所述tsg101蛋白的方法，其中所述哺乳動物細胞為人類細胞。所述抗體結合的表位包括在選自組成的組的氨基酸區(qū)域的vretvnvitlykdlkpvl(SEQID NO：2)和qlralmqkarktaglsdly(SEQ ID NO：3)。

中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院生物工程研究所于2017年3月13日在中國申請專利CN106868025A，公開了一種用酵母制備三聚體埃博拉病毒糖蛋白突變體的方法該方法包括如下步驟：1)將編碼埃博拉病毒糖蛋白突變體(缺失了黏蛋白樣區(qū)域和C-端穿膜區(qū)的埃博拉病毒糖蛋白)的基因導入受體酵母細胞中，得到重組酵母細胞；2)對重組酵母細胞依次進行培養(yǎng)、破碎，從破碎產物中獲得埃博拉病毒糖蛋白突變體。用本發(fā)明制備的埃博拉病毒糖蛋白突變體所制備的埃博拉出血熱預防用疫苗，可誘導小鼠產生顯著的針對埃博拉病毒糖蛋白的抗體滴度。本發(fā)明具有工程菌株構建、培養(yǎng)周期短、培養(yǎng)條件簡單、成本低、適于大規(guī)模發(fā)酵、安全、無毒素產生以及可進行蛋白質翻譯后修飾加工等典型特點，適合在突發(fā)疫情等應急條件下，進行疫苗高效研發(fā)和大規(guī)模生產。

2.2.2 非病毒樣顆粒

中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院生物工程研究所于2014年3月4日在中國申請的CN103864904A號專利公開了暴露于GP蛋白表面的中部區(qū)域(aa393-556)在GP蛋白功能的發(fā)揮中具有關鍵作用，且該區(qū)域含有豐富的GP蛋白抗原表位。本發(fā)明提供的抗原片段是來自埃博拉病毒(Zaire)包膜蛋白GP的一段序列(aa393-556)以及該序列的截短體。本發(fā)明提供的抗原片段L具有作為GP蛋白相似的抗原潛力，免疫產生的中和抗體能夠有效抑制病毒的感染。與完整的GP蛋白抗原相比，該抗原片段不具有GP蛋白的生物學功能(不具有GP1亞基與GP2亞基的功能，在病毒進入過程中只發(fā)揮輔助功能)，因此不能使病毒進入宿主細胞，該片段用于病毒載體疫苗的構建時具有更好的安全性，也更方便用于多價疫苗制備。抗原片段L進一步截短后也能夠誘導較強的體液免疫反應，具有良好的免疫原性，可應用于埃博拉病毒疫苗的開發(fā)及中和抗體的制備。pVAX1載體組的實驗結果與生理鹽水1組的實驗結果無顯著性差異。抗原L能夠有效誘導中和抗體的產生，對假病毒感染細胞的中和能力與抗原GP相當?？乖璍的三個截短體LA、LB及LM也能不同程度地抑制假病毒的感染，即三個截短體也能夠產生不同水平的中和抗體。

MICROVAX公司于2016年11月2日在美國提出專利申請：US9889188B1公開了三種肽主要結合抗體并且來自相同的GP1蛋白，并且它們各自相對較短(每個長度約16個氨基酸)。這三種肽與ecdCD40L融合在一起作為第一種組合物和/或疫苗的一部分，而SEQ ID NO.4與ecdCD40L分開融合，作為第二種組合物和/或疫苗，它是一種相對較長的氨基酸列表。60個氨基酸，主要含有細胞受體的接觸位點。當在病毒攻擊前24小時施用100微克抗體時，結合這些肽的每種抗體將保護小鼠免受致命的埃博拉攻擊。隨著抗體劑量降至25微克，受保護小鼠的百分比降低。與肽2(SEQ ID NO.2)結合的抗體中和埃博拉病毒的感染性，而與肽1和3(SEQ ID NO：1和3)結合的抗體則沒有。盡管與肽1-3(SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.3)結合的抗體可以結合來自Zaire的兩種埃博拉菌株的GP1，但它們不結合來自象牙海岸或蘇丹的埃博拉病毒株。衍生這3種肽的GP1區(qū)域在埃博拉病毒株中保守性差，并且在可溶性形式的GP1中不是任何區(qū)域共有的。基于這些肽被埃博拉的中和抗體識別，提出肽1-3(SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.3)與ecdCD40L連接以產生組合物和/或疫苗。

三、總結與展望

基因工程亞單位疫苗中病毒樣顆粒疫苗的研究開始較早，病毒樣顆粒(Virus-like particles，VLPs)是單獨由病毒衣殼蛋白或與囊膜蛋白共同自主包裝形成的空衣殼結構，VLPs能夠模擬天然病毒粒子，能有效刺激機體產生體液免疫和細胞免疫應答。而且病毒樣顆粒不含有核酸遺傳物質，安全性好。由于VLPs疫苗比傳統滅活和減毒活疫苗更加安全有效，因此已被用于多種疾病疫苗的研究。埃博拉VLPs疫苗要真正實際應用，還要解決其生產的問題，由于前期研究的VLPs均由293T生產，無法滿足大量生產。埃博拉VLPs疫苗較載體疫苗更為安全，如果能夠進一步提高其免疫原性，縮短免疫周期，其有望成為最有潛力的埃博拉疫苗。

綜上，基因工程亞單位疫苗仍是研究的主體方向，由于基因工程亞單位疫苗較傳統亞單位疫苗免疫效果較差，因此在保證毒性更小更安全的前提下，找尋疫苗免疫原性更強的抗原基因及其修飾位點仍是主要研究方向。并且可從調整基因組合入手，聯合具有靶向免疫增強等功能性的新型載體佐劑而制備出更安全有效的疫苗。