李燕青，劉夏瑩，謝俊杰，傅婉玉，王元白，莊建龍，江矞穎

超聲異常為產(chǎn)前診斷中常見(jiàn)的就診因素，包括超聲軟指標(biāo)異常和結(jié)構(gòu)異常等情況。超聲軟指標(biāo)異常是胎兒超聲影像學(xué)檢查異常情況，非結(jié)構(gòu)性異常[1]。目前有研究認(rèn)為，胎兒超聲軟指標(biāo)陽(yáng)性提示染色體異常的風(fēng)險(xiǎn)和發(fā)生嚴(yán)重畸形的風(fēng)險(xiǎn)增加，但畸形不存在特異性[2]。

染色體核型分析作為目前產(chǎn)前診斷的常用手段及技術(shù)途徑之一[3]，仍存在一定的局限性，染色體片段大于5 Mb的敏感度較好，一般分辨率為10 Mb[4]，對(duì)染色體上微小片段（小于3～5 Mb）缺失和重復(fù)的敏感度差，且無(wú)法準(zhǔn)確定位額外小標(biāo)記染色體的來(lái)源[5]。染色體核型分析需要進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，存在培養(yǎng)失敗的風(fēng)險(xiǎn)，報(bào)告周期長(zhǎng)。

染色體微陣列分析（chromosomal microarray analysis，CMA）是一項(xiàng)新興的染色體分析技術(shù)，能夠檢測(cè)出大于1 kb的拷貝數(shù)變異（copy number variations，CNVs）[6]。與染色體核型分析相比，CMA 的分辨率和自動(dòng)化程度更高，檢測(cè)周期更短，彌補(bǔ)了染色體核型分析的不足，現(xiàn)常用于染色體及基因組層面的產(chǎn)前篩查與診斷[7]。臨床應(yīng)用上，單核苷酸多態(tài)性芯片（single nucleotide polymorphism array，SNP-array）檢測(cè)技術(shù)是目前臨床上最常用的CMA[8]，SNP-array除了能檢測(cè)CNVs變異外，其SNP探針還可檢出雜合性丟失（loss of heterozygosity，LOH）和單親二倍體（uniparental disomies，UPD）等[9]。目前 CMA 在臨床應(yīng)用的指征仍存在爭(zhēng)議[10]。現(xiàn)對(duì)278例因胎兒超聲異常的孕婦聯(lián)合應(yīng)用染色體核型分析和全基因組SNP-array檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行產(chǎn)前診斷，探討全基因組SNP-array技術(shù)的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 回顧性收集2017年1月1日—2018年12月31日在泉州市婦幼保健院·兒童醫(yī)院（我院）產(chǎn)前診斷中心就診的有介入性產(chǎn)前診斷指征、無(wú)相關(guān)手術(shù)禁忌證的胎兒超聲異常、單胎、孕18～26周、自愿進(jìn)行羊膜腔穿刺術(shù)的孕婦278例。納入指征包括超聲結(jié)構(gòu)異常和超聲軟指標(biāo)異常。常規(guī)告知羊膜腔穿刺術(shù)的風(fēng)險(xiǎn)性，并簽署羊膜腔穿刺術(shù)及SNP-array檢測(cè)知情同意書(shū)。

1.2 研究方法

1.2.1 標(biāo)本采集及處理 羊膜腔穿刺術(shù)和羊水染色體核型分析均在我院完成，采用超聲引導(dǎo)下羊膜腔穿刺技術(shù)，抽取30 mL羊水分別進(jìn)行羊水染色體核型分析和SNP-array檢測(cè)。染色體的命名依據(jù)人類(lèi)細(xì)胞遺傳學(xué)國(guó)際命名體制（ISCN，2016）的標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 SNP-array檢測(cè) 簽署知情同意書(shū)后將采集的10 mL羊水樣本送至第三方檢測(cè)公司（北京貝康醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所）進(jìn)行檢測(cè)，SNP-array采用美國(guó)Affymetrix CytoSan 750K array芯片，通過(guò)ChAS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.3 隨訪 采用隨機(jī)雙盲法進(jìn)行電話隨訪，記錄妊娠結(jié)局等相關(guān)情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，定量資料正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，定性資料用例（%）表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)，不符合卡方檢驗(yàn)條件的數(shù)據(jù)用Fisher確切概率法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 檢測(cè)結(jié)果分析 278例胎兒羊水標(biāo)本進(jìn)行了染色體核型分析，其中2例培養(yǎng)失敗，276例（99.28%）培養(yǎng)成功。278例羊水標(biāo)本SNP-array檢測(cè)均得到了結(jié)果，檢測(cè)成功率100%。為比較染色體核型分析和SNP-array檢測(cè)的陽(yáng)性檢出差異，排除實(shí)驗(yàn)室人為因素干擾，在兩者對(duì)比研究中排除染色體核型分析失敗案例。比較染色體核型分析及SNP-array檢測(cè)均成功的276例情況，染色體核型分析陽(yáng)性檢出率8.33%（23/276）；SNP-array檢測(cè)陽(yáng)性檢出率 17.03%（47/276），2種檢測(cè)方法陽(yáng)性檢出率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=9.424，P=0.002）。染色體核型正常的 253例孕婦中，SNP-array陽(yáng)性檢出率為11.46%（29/253），其中致病性CNVs檢出率為2.76%（7/253），臨床意義不明確的拷貝數(shù)變異（variantsofunknownsignificance，VOUS）檢出率為 8.70%（22/253）。

2.2 染色體核型分析與SNP-array檢測(cè)結(jié)果比較 染色體核型分析檢出染色體數(shù)目異常11例，均與SNP-array檢測(cè)結(jié)果相一致，見(jiàn)表1。核型分析檢出2例性染色體嵌合經(jīng)SNP-array檢測(cè)確認(rèn)是男性胎兒，性染色體部分缺失。核型分析檢出臂間倒位及平衡易位共6例，其中3例遺傳自表型正常的父母一方，3例新發(fā)突變，SNP-array在其中1例Y染色體倒位和1例9號(hào)染色體倒位中分別發(fā)現(xiàn)5號(hào)染色體微缺失和意義不明的1號(hào)染色體微重復(fù)。核型分析發(fā)現(xiàn)2例9qh+，經(jīng)SNP-array驗(yàn)證分別為5號(hào)染色體及11號(hào)染色體微缺失，均為不明意義異常，未行父母驗(yàn)證。1例15ps+經(jīng)SNP-array驗(yàn)證未發(fā)現(xiàn)異?？截悢?shù)。SNP-array檢出6例致病性CNVs，核型分析僅檢出其中1例10 Mb以上無(wú)法辨別結(jié)構(gòu)畸變的標(biāo)記染色體（marker chromosome，mar），經(jīng) SNP-array 確定該mar為13號(hào)染色體來(lái)源的片段重復(fù)。SNP-array檢出1例伴有X染色體微重復(fù)和16號(hào)染色體微缺失的14號(hào)染色體UPD和2例LOH，核型分析未檢出異常。SNP-array另外檢出22例VOUS，其中5例經(jīng)父母驗(yàn)證證實(shí)遺傳自表型正常的父母一方，2例為新發(fā)突變，其余15例未驗(yàn)證。

2.3 不同類(lèi)型超聲異常SNP-array檢出情況 納入病例按照超聲異常類(lèi)型分為3組，超聲結(jié)構(gòu)異常組79例，單項(xiàng)超聲軟指標(biāo)異常組111例，多發(fā)超聲軟指標(biāo)異常組86例。超聲軟指標(biāo)是指臨床意義尚未能完全明確的異常超聲發(fā)現(xiàn)，包括頸項(xiàng)透明層（NT）增厚、持續(xù)性脈絡(luò)膜囊腫、鼻骨短小等[11]。多發(fā)超聲軟指標(biāo)異常組指彩超篩查出2個(gè)或以上超聲軟指標(biāo)。

3組患者染色體核型異常檢出率、SNP-array陽(yáng)性檢出率、SNP-array結(jié)果類(lèi)型構(gòu)成、致病性CNVs類(lèi)型構(gòu)成比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見(jiàn)表2。本研究發(fā)現(xiàn)NT增厚、骨骼肌肉及心血管系統(tǒng)異常胎兒的陽(yáng)性CNVs檢出率最高，其次為泌尿系統(tǒng)畸形和單項(xiàng)超聲軟指標(biāo)異常胎兒。顏面部異常、消化系統(tǒng)畸形、呼吸系統(tǒng)畸形等胎兒均未檢出致病性CNVs，見(jiàn)表 3。

表1 羊水染色體核型分析和SNP-array檢測(cè)結(jié)果比較[%（n/n）]

2.4 妊娠結(jié)局隨訪 隨訪時(shí)間為生后3～6個(gè)月。11例染色體數(shù)目異常經(jīng)遺傳咨詢(xún)后均選擇終止妊娠。9例致病性微缺失/微重復(fù)經(jīng)遺傳咨詢(xún)后5例選擇終止妊娠，2例失訪，2例Y染色體微缺失胎兒選擇繼續(xù)妊娠，未成年尚無(wú)法得知生育影響。目前均表型正常25例VOUS中19例經(jīng)遺傳咨詢(xún)后選擇繼續(xù)妊娠，生后隨訪均表型正常；5例選擇終止妊娠，1例失訪。2例LOH經(jīng)遺傳咨詢(xún)后均選擇繼續(xù)妊娠，隨訪生后表型正常。

3 討論

目前國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究均表明，胎兒超聲異常提示染色體異常可能性增加[12-13]。對(duì)不同種類(lèi)超聲異常的研究認(rèn)為，不同種類(lèi)及數(shù)量的超聲軟標(biāo)記或結(jié)構(gòu)畸形的染色體異常發(fā)生率不同，需進(jìn)一步進(jìn)行染色體核型分析和染色體微陣列分析，完善產(chǎn)前檢查與診斷[14]。有研究指出，超聲異常和正常核型的胎兒中有9.1%的胎兒能檢測(cè)到與臨床相關(guān)的CNVs[15]。

表2 各類(lèi)型超聲異?；颊呷旧w核型異常和SNP-array結(jié)果異常比較[例（%）]

表3 超聲異常各系統(tǒng)染色體CNVs檢出情況匯總表[例（%）]

本研究發(fā)現(xiàn)SNP-array檢測(cè)陽(yáng)性檢出率比染色體核型分析高，這與目前的相關(guān)研究[16]結(jié)果一致。SNP-array檢測(cè)雖然可在一定程度上發(fā)現(xiàn)染色體微小缺失或重復(fù)，但是這些微缺失或微重復(fù)不一定具有臨床價(jià)值，這些意義不明的變異仍需進(jìn)一步的探索和研究。

3.1 SNP-array檢測(cè)臨床應(yīng)用的必要性 目前國(guó)外的相關(guān)研究認(rèn)為，當(dāng)產(chǎn)前超聲檢查發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)異常時(shí)，約6%染色體核型正常的胎兒使用SNP-array檢測(cè)能發(fā)現(xiàn)臨床意義重大的染色體異常[17-18]。本研究表明，超聲異常但染色體核型正常胎兒中，約有11.46%胎兒SNP-array結(jié)果異常，其中致病性CNVs檢出率為2.76%，VOUS檢出率為8.70%。本研究與既往研究結(jié)果存在差異，可能是因?yàn)楸狙芯績(jī)H納入完成染色體核型分析和SNP-array檢測(cè)的病例，未完整納入全部超聲異常胎兒。由于染色體微陣列分析的敏感度高于傳統(tǒng)的染色體核型分析，目前臨床上染色體微陣列分析應(yīng)用日益廣泛，尤其在高危妊娠婦女的產(chǎn)前診斷中[19]。

染色體核型分析無(wú)法準(zhǔn)確定位額外小標(biāo)記染色體 （small supernumerary marker chromosomes，sSMC）的來(lái)源，需要聯(lián)合分子生物學(xué)檢測(cè)進(jìn)行分析[20]。本研究中1例超聲提示胎兒鼻骨偏短，羊水染色體核型47，XN，+mar，經(jīng) SNP-array確定 sSMC 為 13號(hào)染色體來(lái)源異常，胎兒在13號(hào)染色體13q33.1q34區(qū)段存在11.9 Mb片段的重復(fù)，內(nèi)含37個(gè)OMIM基因，與常染色體顯性遺傳的腦穿通畸形（porencephaly）、智力障礙（mental retardation）等疾病相關(guān)，通過(guò)SNP-array檢測(cè)可明確標(biāo)記染色體來(lái)源，并及時(shí)對(duì)胎兒的預(yù)后進(jìn)行預(yù)估。通過(guò)遺傳咨詢(xún)，家屬選擇終止妊娠。

3.2 染色體核型分析臨床應(yīng)用的重要性 2016年，美國(guó)婦產(chǎn)科醫(yī)師學(xué)會(huì)（AmericanCollegeofObstetricians and Gynecologists，ACOG）和母胎醫(yī)學(xué)會(huì)（Society for Maternal-Fetal Medicine，SMFM） 發(fā)布指南《2016 ACOG/SMFM實(shí)踐簡(jiǎn)報(bào)：遺傳性疾病產(chǎn)前診斷檢測(cè)（No.162）》（Practice Bulletin No.162:Prenatal Diagnostic Testing for Genetic Disorders）指出，對(duì)于超聲檢查發(fā)現(xiàn)胎兒結(jié)構(gòu)異常的，產(chǎn)前診斷患者應(yīng)推薦染色體微陣列分析作為主要檢測(cè)手段（取代常規(guī)核型）[21]。

但王敏等[22]認(rèn)為，對(duì)NT異常胎兒的產(chǎn)前診斷采用染色體核型＋SNP-array檢測(cè)模式。本研究發(fā)現(xiàn)，胎兒NT增厚不僅與染色體微小變異密切相關(guān)，與染色體結(jié)構(gòu)異常及數(shù)目異常也密切相關(guān)。11例染色體數(shù)目異常中有8例表現(xiàn)為NT增厚，核型分析發(fā)現(xiàn)其中13-三體為易位型異常；6例致病性CNVs中有4例表現(xiàn)為NT增厚。因此本研究建議胎兒NT增厚時(shí)應(yīng)采用染色體核型＋SNP-array檢測(cè)模式。

雖然已有指南支持染色體微陣列分析取代染色體核型分析，但SNP-array對(duì)胎兒染色體結(jié)構(gòu)異常無(wú)法檢測(cè)，因此本研究仍然認(rèn)為染色體微陣列分析不能完全取代染色體核型分析。

3.3 VOUS給產(chǎn)前診斷帶來(lái)困擾 雖然染色體微陣列分析可以提高胎兒染色體疾病的檢出率，但是隨著分辨率的提高，在檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)許多與臨床表型相關(guān)性不明確的CNVs，CNVs的片段涉及臨床表型功能不明或劑量效應(yīng)不明確的基因，或者既存在于正常表型人群中同時(shí)也有病理性表型的報(bào)道[23]。本研究中1例超聲提示胎兒腸道回聲增強(qiáng)、左心室點(diǎn)狀強(qiáng)回聲，羊水染色體核型未見(jiàn)異常，羊水SNP-array提示為女性胎兒，該患者在X染色體Xp22.31區(qū)段存在534.6 kb片段的重復(fù)，經(jīng)過(guò)驗(yàn)證為遺傳至表型正常的母親，雖然經(jīng)過(guò)充分的咨詢(xún)指導(dǎo)，孕婦及家屬仍選擇終止妊娠。VOUS的出現(xiàn)給孕婦及家屬帶來(lái)巨大的壓力，也給臨床醫(yī)生帶來(lái)了很大的挑戰(zhàn)。希望通過(guò)對(duì)數(shù)據(jù)的長(zhǎng)期積累，更好地指導(dǎo)臨床工作中對(duì)于發(fā)生率較高的、偏良性的VOUS報(bào)告的解讀及咨詢(xún)，避免過(guò)度診療。

綜上，染色體核型分析和SNP-array檢測(cè)在超聲異常胎兒中具有良好的應(yīng)用價(jià)值和應(yīng)用空間。與核型分析相比，SNP-array檢測(cè)在異常結(jié)果檢出率上存在一定優(yōu)勢(shì)，可以在一定程度彌補(bǔ)核型分析對(duì)微缺失、微重復(fù)的不足，但對(duì)VOUS的研究仍需要進(jìn)一步的深入。