王力源，麻蕓嬌，李文杰，劉興菊,梁海永

(1河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，河北 保定 071000；2河北省林木種質(zhì)資源創(chuàng)新與保護(hù)實驗室，河北 保定 071000)

對于高等植物來說，環(huán)境溫度是影響植物存活和生長發(fā)育的重要因素之一，低溫脅迫通常明顯大于其他環(huán)境因素脅迫[1-3]。1930 年，Dexter 首次將電導(dǎo)法用來研究植物的抗寒性，此后該方法不斷改進(jìn)發(fā)展，電導(dǎo)法已經(jīng)成為研究抗寒性強弱的主要方法[4]，此外前人還對各種植物抗寒性研究提出許多方法。相關(guān)研究表明，可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、游離脯氨酸含量、抗逆酶含量和電導(dǎo)率等與植物的抗寒性有密切相關(guān)。馬曉蕊等研究表明，植物組織中可溶性糖含量越高，植物組織細(xì)胞液的滲透壓越高，植物抗寒性越強[5]。田介云等研究表明，仁用杏在低溫過程中的抗寒性強弱與植物組織中可溶性蛋白含量密切相關(guān)[6]。韓立群等認(rèn)為植物在受到低溫脅迫的時候，游離脯氨酸含量發(fā)生明顯變化，因此表明低溫脅迫會對植物組織中游離脯氨酸含量產(chǎn)生影響[7]。悅沖認(rèn)為植物的抗寒性與游離脯氨酸含量密切相關(guān)[8]。歐歡對不同扁桃品種的枝條進(jìn)行低溫脅迫，發(fā)現(xiàn)抗逆酶活性的升高與降低，可以反映扁桃的抗寒性強弱[9]。

榆樹(UlmuspumilaL.)為榆屬植物的總稱，約有 40 余種，主要分布于歐洲、亞洲和美洲，我國有24 種，南北均可生長。榆樹為陽生樹種，喜光，抗寒，耐旱，耐瘠薄，對氣候、土壤等適應(yīng)性較強，榆樹曾是我國北方五大闊葉造林樹種之一，也是河北主要的鄉(xiāng)土樹種之一，由于其根系發(fā)達(dá)，枝葉繁茂，且具有良好的抗寒抗旱、耐鹽堿、抗病和抗風(fēng)性，壽命長，在水分匱乏的沙地和沙丘上能生長，使得榆樹成為我國北方廣大平原、干旱草原、濱海鹽堿地、沙荒地營造用材林和防護(hù)林的重要樹種[10-11]。我國北方氣候冬季寒冷干燥，早春易出現(xiàn)大風(fēng)天氣，多數(shù)林木不易成活，因此收集并選育抗寒性強、生長迅速的榆樹新品種，是解決北方樹木凍害的關(guān)鍵。近些年來，作為北方寒冷地區(qū)造林的理想樹種，關(guān)于榆樹的研究越來越受到廣泛的重視。

為此，以來自 3 個榆樹種的 9 個無性系為研究材料，通過對比不同低溫處理下，各榆樹枝條的生理響應(yīng)，運用隸屬函數(shù)法進(jìn)行抗寒性綜合評定，比較不同榆樹無性系的抗寒性強弱，探討榆樹在寒冷環(huán)境下，產(chǎn)生的生理變化，旨在為榆樹育種雜交親本選擇提供依據(jù)，對選育有較強抗寒性的榆樹無性系提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與處理

于2018年12月-2019年2月，在張家口涿鹿的苗圃基地選取砧木相同的白榆(D1520、D1507、D1526)；黑榆(D2、H1506、D28)；春榆(Y1、B19、Y3)等3個樹種共9個無性系，每個無性系選取3株長勢相同的3 a生嫁接苗資源進(jìn)行試驗，對其不同榆樹無性系的1 a生枝條進(jìn)行研究，盡量保證枝條的各方面一致性，以保證試驗數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗材料采集 采集樹冠南側(cè)，直徑 0.8 cm～1.0 cm的枝條，每株枝條數(shù)量相同。材料采集回來以后，把枝條剪成 20 cm左右，同一無性系枝條混合均勻，并將材料進(jìn)行清洗，去除表面塵土等污染物，再用干凈紗布輕輕吸干枝條上的水分，然后在枝條兩端涂抹凡士林，防止水分流失，每個無性系平均分成5份，每份分得3個枝條，用濕紗將分好的枝條布包起來，分別置于 4 ℃、 -10 ℃、 -20 ℃、 -30 ℃、 -40 ℃的冰箱中，進(jìn)行的低溫脅迫處理。處理 24 h 后，取出在 4 ℃ 放置 24 h 進(jìn)行解凍。

1.2.2 抗寒性生理指標(biāo)方法 采用李合生的試驗方法測定榆樹枝條的各種生理指標(biāo)[12]。

細(xì)胞膜透性試驗處理，細(xì)胞膜透性采用電導(dǎo)法測定：將不同溫度梯度下 3 個枝條剪切成2～3 cm小段，稱取質(zhì)量(3次重復(fù))，按照0.1 g枝段加水20 g加入蒸餾水，真空處理40 min，靜止20 min，用電導(dǎo)率儀測量初始電導(dǎo)及空白水電導(dǎo)測定，之后放入水浴鍋100 ℃煮沸20 min，取出靜止12 h，進(jìn)行終止電導(dǎo)及處理后空白水測定，計算枝條相對電導(dǎo)率[13]。

酶液制備：將不同溫度梯度下 3 個枝條的韌皮部剪碎混合均勻，準(zhǔn)確稱取 0.3 g (3次重復(fù))，置于預(yù)冷的研缽中，先加 2 mL 50 mmol/L pH =7.8磷酸緩沖液，少許石英砂，快速而充分的研磨成勻漿狀態(tài)，再用 6 mL磷酸緩沖液清洗干凈，搖勻。在 10 000 rpm冷凍( 4 ℃ )離心 20 min，離心結(jié)束后，上清液為可溶性蛋白、POD、 SOD 、CAT和 MDA粗提酶液，倒出來放入提前標(biāo)記好的離心管中讀取上清液體積并記錄，于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

自然越冬指標(biāo)：硫代巴比妥酸(TBA)法測定丙二醛含量；可溶性蛋白的測定使用考馬斯亮藍(lán) G-250 染色法；對游離脯氨酸進(jìn)行磺基水楊酸提取，茚三酮顯色法測定；蒽酮顯色法測定可溶性糖含量。

低溫脅迫指標(biāo)：細(xì)胞膜透性采用電導(dǎo)法測定[13]；抗逆酶活性測定：氮藍(lán)四唑法(SOD)、紫外吸收法(CAT)，愈創(chuàng)木酚法(POD)。

1.2.3 半致死溫度計算及生理指標(biāo)分析 采用孫宜等的方法將相對電導(dǎo)率擬合 Logistic 曲線方程[14]：

y=k/ (1+ae-bt)

(1)

式(1)中y為相對電導(dǎo)率；t為溫度梯度；k為極限相對電導(dǎo)率，為100%；a和b為待定系數(shù)。對式(1)求二階導(dǎo)數(shù)，并令其為零，得式(2)：

t=lna/b

(2)

式(2)為相對電導(dǎo)率隨溫度下降而增加最快時的溫度，即LT50(或組織崩潰點)依據(jù)式(1)和(2)計算低溫半致死溫度LT50。

利用Excel 2003軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和相關(guān)性分析；運用 SPSS 20 軟件進(jìn)行差異顯著性檢驗(P=0.05)以及主成分分析。運用隸屬函數(shù)法，對各指標(biāo)求得的隸屬值進(jìn)行累加、取平均數(shù)。按照從大到小的順序?qū)Ω鱾€樹種的反隸屬函數(shù)平均值進(jìn)行排序，可對各榆樹無性系進(jìn)行抗寒性綜合評價。

3 結(jié)果與分析

3.1 低溫脅迫下各榆樹無性系生理指標(biāo)

3.1.1 不同榆樹枝條相對電導(dǎo)率的變化情況 在低溫脅迫下，9個無性系枝條的相對電導(dǎo)如圖1。

圖1 低溫脅迫下各榆樹無性系相對電導(dǎo)率變化趨勢Figure 1 The changes in relative conductivity of Ulmus clonesunder low temperature stress

圖1可知，隨著脅迫溫度的降低，9 個無性系枝條的相對電導(dǎo)率逐漸增大(圖1)， 但各無性系相對電導(dǎo)率的變幅不同?？傮w上看，9 個無性系的相對電導(dǎo)率均呈“緩慢升高—迅速升高—平穩(wěn)升高”的“ S ” 型曲線，其中從常溫到 -30 ℃ 相對電導(dǎo)率變化幅度不大，-30～-40 ℃ 相對電導(dǎo)率快速增加，變幅較大 。枝條細(xì)胞膜受害越嚴(yán)重是相對電導(dǎo)率變化幅度越大的主要原因，表明該榆樹無性系對低溫更敏感，可以初步推測：D1520的抗寒性最強，D1507 、 D1526 、 D2 、 H1506 、Y1、B19 的抗寒性次之， Y3、 D28的抗寒性較弱。榆樹各無性系的拐點在 -30～-40 ℃ 之間。

通過人工低溫處理下的相對電導(dǎo)率變化曲線結(jié)合Logistic方程，可以擬合出D1520、D1507、D1526、D2、H1506、Y1、B19、Y3、D28的拐點溫度來表示半致死溫度見表 1。

表1 榆樹各無性系的半致死溫度Table 1 The semi-lethal temperature of each Ulmus clone

依據(jù)表 1中數(shù)據(jù)可見: 9 個無性系 Logistic 方程的相關(guān)系數(shù)為 0.958～0.996，均達(dá)到顯著(P<0.05) 或極顯著(P<0.01) 水平。同時可得出D1520的半致死溫度為 -40.83 ℃，D28的半致死溫度為 -33.67 ℃；因半致死溫度越高，抗寒性越弱，半致死溫度越低，說明其忍耐低溫的能力越強，因此我們根據(jù)表1中數(shù)據(jù)可以得到榆樹不同無性系抗寒性強弱依次為：D1520 、 D1507 、 D1526 、 D2 、 H1506 、 Y1 、 B19、 Y3、 D28。由此可知無性系D1520、D1507的抗寒性較強，Y3、D28 抗寒性較差,進(jìn)而初步確定抗寒性白榆>黑榆>春榆。

3.1.2 低溫脅迫對不同榆樹抗逆酶酶活性的影響 在低溫脅迫下，參試的 9 種榆樹POD 活性測定結(jié)果見圖2。

圖2 低溫脅迫下各榆樹無性系POD活性的變化Figure 2 The changes in POD activity of various Ulmusclones under low temperature stress

圖2可知，在整個低溫處理過程中，D1520 、D1507系列的POD活性處于較高水平，而Y3的POD活性較低。 D1520 、D1507 、D2、 H1506 、 D28等榆樹無性系從常溫到 -10 ℃ 時，POD活性開始升高，從 -10～-40 ℃ 時出現(xiàn)下降趨勢；Y1系列從常溫到 -10 ℃ 時，POD活性變化比較平緩，在從 -10～-20 ℃ 時出現(xiàn)開始升高，之后出現(xiàn)下降趨勢；B19 和 Y3 系列從低溫脅迫開始POD 活性就一直明顯的下降；D1526 系列從低溫脅迫則從開始POD 活性就一直在上升。

在低溫脅迫下，參試的9種榆樹SOD活性測定結(jié)果見圖3。

圖3 低溫脅迫下各榆樹無性系SOD活性的變化Figure 3 The changes in SOD activity of various Ulmusclones under low temperature stress

由圖3可知，在整個脅迫處理過程中，D1520的SOD活性在-20℃達(dá)到高值，是所有無性系中最高的；而Y1的SOD活性的高值出現(xiàn)在-10 ℃，比所有無性系均低；Y3在 -30～-40 ℃ 時，酶活性基本沒變。D1507、 D1526 、 D2 、H1506 、Y1 、 Y3、D28系列從常溫到 -10 ℃ 時，SOD活性開始升高，從-10～-40 ℃ 時，SOD活性一直在明顯下降。D1520 和B19系列從常溫到 -20 ℃ 時，SOD 活性呈現(xiàn)上升趨勢，從-20～-40 ℃ 時，SOD 活性則開始下降。

在低溫脅迫下，參試的9種榆樹CAT活性測定結(jié)果見圖4。

圖4 低溫脅迫下各榆樹無性系CAT活性的變化Figure 4 The changes in CAT activity of various Ulmusclones under low temperature stress

由圖4可知，在整個低溫處理過程中，D1526、D1507以及D1520的CAT活性處于較高水平，而D28、Y1的CAT活性較低，榆樹各無性系從常溫到-10℃時，CAT活性開始小幅度上升；從-10～-20℃時，除D1507出現(xiàn)上升情況外，其余各無性系均呈現(xiàn)小幅度降低；除H1506外，從-20～-30℃大多無性系均緩慢下降，溫度繼續(xù)降至-40℃時，CAT活性明顯下降。

3.2 越冬期間各榆樹無性系部分生理指標(biāo)

3.2.1 越冬期間各榆樹無性系可溶性糖和可溶性蛋白含量變化 不同月份中，參試的9種榆樹無性系可溶性糖含量測定結(jié)果見圖5，可溶性蛋白含量測定結(jié)果見圖6。

圖5 不同月份各榆樹無性系的可溶性糖含量Figure 5 The soluble sugar content of each Ulmusclone in different months

圖6 不同月份各榆樹無性系的可溶性蛋白含量Figure 6 The soluble protein content of each Ulmusclone in different months

由圖5可知，可以看出各榆樹無性系的可溶性糖含量在冬季均在升高，其中D1520、D1526上漲較快，二月份漲幅分別為71.37%、74。20%；Y1、D28均上漲較慢，漲幅分別為15.91%、17.41%；而Y3甚至出現(xiàn)下降現(xiàn)象，下降了19.45%。

由圖6可知，可以看出，除D1526和D28出現(xiàn)下降外，各榆樹無性系的可溶性蛋白含量在冬季均在升高，其中D1507上漲較快，上漲了39.67%；Y1均上漲較慢為6.53%，而D28甚至出現(xiàn)下降現(xiàn)象，降幅為11.24%。

3.2.2 越冬期間各榆樹無性系游離脯氨酸與MDA含量變化 在越冬期間的不同月份中，參試的9種榆樹游離脯氨酸含量測定結(jié)果見圖7。

圖7 不同月份各榆樹無性系的游離脯氨酸含量Figure 7 The free proline content of Ulmus clonesin different months

由圖7可知，可以看出各榆樹無性系的游離脯氨酸含量在冬季均在升高，其中Y3、Y1上漲較快，在2月份漲幅分別為85.44%、64.61% ；D1520與D1507均上漲較慢，在2月份漲幅分別為38.95%、36.03%。

MDA活性測定結(jié)果見圖 8。

圖8 不同月份各榆樹無性系的丙二醛含量Figure 8 The MDA content of each Ulmus clonein different months

由圖8可知，由圖8可知，在各種榆樹無性系，除D2、Y1、先上升后下降，其余無性系均呈現(xiàn)上升趨勢，但是D1520、D1507和D1526趨勢不明顯；而Y3及D28上漲趨勢較大。在整個冬月中，Y3的MDA活性均處于較高水平，而D1526、D1507的MDA活性較低。

4 利用隸屬函數(shù)法進(jìn)行抗寒性綜合評定

植物抗寒性是一個復(fù)雜的生理生化過程，受多種因素的影響，單一指標(biāo)很難反應(yīng)抗寒本質(zhì)，采用模糊數(shù)學(xué)中的隸屬函數(shù)的方法，以9個榆樹無性系枝條1月份的低溫脅迫下對照組相對電導(dǎo)率、SOD、POD、CAT以及可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、游離脯氨酸含量、MDA的平均隸屬函數(shù)值，得隸屬函數(shù)加權(quán)平均值作為植物種抗寒性的綜合評定標(biāo)準(zhǔn)，消除了個別指標(biāo)帶來的片面性，目前這一方法已廣泛應(yīng)用[15]。不同榆樹各指標(biāo)隸屬函數(shù)值和綜合評定結(jié)果見表2。

綜合評定值越大，說明其抗寒性越強，在表2中可以發(fā)現(xiàn)D1520 這個無性系抗寒性最強，D28抗寒性最弱，9種榆樹無性系抗寒性由強到弱依次為：D1520、 D1507、 D1526、D2、H1506、 Y1、 B19、 Y3、 D28。

表2 不同榆樹各指標(biāo)隸屬函數(shù)值和綜合評定結(jié)果Table 2 The membership function values and comprehensive evaluation results of different indicators of different Ulmus

5 結(jié)論與討論

可溶性糖和可溶性蛋白是植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物，有研究表明，在低溫條件下，植物可通過滲透調(diào)節(jié)作用減輕傷害，同時與生物膜系統(tǒng)有關(guān)的相對電導(dǎo)率、MDA 含量會呈現(xiàn)增加趨勢[16-17]。本試驗研究可知，對于越冬階段，參試的榆樹無性系韌皮部中可溶性糖含量，抗寒性強的無性系可溶性糖含量明顯高于抗寒性差的無性系，這與韓俊威[18]研究結(jié)果相一致；榆樹無性系的可溶性蛋白含量呈增加趨勢，抗寒性強的品種增加幅度大，抗寒性差的品種增加幅度小，與在核桃[19]和山楊[20]上的研究結(jié)果相一致，存在略微差異可能是在試驗過程中的不嚴(yán)謹(jǐn)導(dǎo)致的。結(jié)果表明在越冬期間，可溶性糖和可溶性蛋白發(fā)揮著滲透調(diào)節(jié)作用。在相同月份下，參試的不同榆樹無性系枝條韌皮部可溶性糖和可溶性蛋白含量與相對電導(dǎo)率均呈顯著正相關(guān)(R2=0.967，R2=0.952 )，游離脯氨酸含量及 MDA 含量與榆樹無性系的相對電導(dǎo)率呈負(fù)相關(guān)(R2=0.984，R2=0.632)，這與前人在紫薇上的研究結(jié)果一致[21]。

不同低溫脅迫下的電導(dǎo)率和抗逆酶活性受溫度影響較大，SOD 能夠清除活性氧，使其生成氧氣與過氧化氫，再通過 CAT 與 POD 分解過氧化氫，從而保護(hù)細(xì)胞免受活性氧的傷害[22-24]。大量研究發(fā)現(xiàn)，植物體在受到脅迫后，其體內(nèi)抗逆酶活性有升有降，且呈現(xiàn)出抗性強無性系活性高于抗性弱無性系的現(xiàn)象[25]。本試驗中，榆樹無性系的SOD 、POD 和 CAT 活性的相關(guān)性較好，說明三者存在密切的互作關(guān)系；并且，抗寒性強的品種其 SOD、POD、CAT 活性較高，抗寒性弱的品種其 SOD、POD、CAT 活性較低，這與前人在仁用杏[27]和蘋果[28]上的研究結(jié)果一致?？鼓婷富钚栽谝欢沙惺軠囟确秶鷥?nèi)，其活性呈現(xiàn)出小幅度上升趨勢，但是達(dá)到一定低溫時，其活性也會降低。

植物的可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、游離脯氨酸含量、SOD 酶活性、POD 酶活性、CAT 酶活性、丙二醛質(zhì)量摩爾濃度等指標(biāo)均與植物的抗寒性強弱息息相關(guān)，但單獨依據(jù)一個指標(biāo)不能直接判斷不同無性系的抗寒性強弱。因此，在評定植物抗寒性時應(yīng)考慮多方面指標(biāo)，并不能靠單一指標(biāo)來判斷[28-30]，隸屬函數(shù)法就是普遍采用的抗性綜合評價方法[29]。在越冬期間不同榆樹無性系間生理變化存在顯著性差異，說明不同無性系抗寒性不同，根據(jù)越冬抗寒指標(biāo)相關(guān)性并采用模糊數(shù)學(xué)隸屬函數(shù)的方法，綜合評價 9個無性系的冬季越冬抗寒性的大小，得出綜合抗寒性由強到弱依次為：D1520、 D1507、 D1526、 D2、 H1506、 Y1、 B19、 Y3、 D28，這與榆樹無性系枝段的半致死溫度排名相一致。本試驗是在離體條件下測定某一月份枝段的相對電導(dǎo)率，獲得的 LT50值與采樣時天氣及是否經(jīng)過低溫鍛煉有關(guān)，雖然 LT50值不一定能確切反映榆樹各無性系的抗寒性，但是可以快速評價取樣時各無性系的抗寒性差異。

綜上所述，依據(jù)9個榆樹無性系的抗寒性的排序結(jié)果可以在不同嚴(yán)寒氣候區(qū)域優(yōu)先選擇種植抗性較強的無性系。其中，無性系D1520具有較強的抗寒性，可以嘗試在北方比較寒冷的高山和荒漠地區(qū)推廣種植。另外，還可以將抗性較強的無性系作為雜交育種的親本，有利于雜交后代增加抗性的積累，并極有可能培育出抗性更高的新無性系。