李向陽，王 楠，朱小章，楊 蒙

（1.凱里學院，貴州凱里 556011；2.復旦大學，上海楊浦 200433）

0 前言

大氣降塵是大氣顆粒物的重要組分之一，粒徑多在10 μm 到100 μm 之間，主要通過降水的方式并在重力作用下自然沉降于地面或沉積在地球表層［1］.大氣降塵來源復雜，可分為人為來源和自然來源，例如，工廠加工過程中產(chǎn)生的工業(yè)粉塵、煤塵、地面揚塵、建筑灰塵以及生物界中的花粉、土壤顆粒物及在自然環(huán)境中新生成的礦物等［2］.大氣降塵對生態(tài)環(huán)境質(zhì)量和人體健康具有重要影響，而且它與人體健康效應各終點的流行病學有著密切聯(lián)系［3-4］.大氣降塵在降水和重力作用下，沉降到土壤、地表水等介質(zhì)中改變土壤的性質(zhì)，加大水源污染；城市與工業(yè)區(qū)生產(chǎn)排放出的污染物還能以揚塵或降塵的形勢釋放到大氣環(huán)境中，降低空氣質(zhì)量；大氣沉降攜帶的細菌還可以通過呼吸、飲食等方式進入人體，給人體健康帶來危害［5-6］.當前對大氣降塵的研究主要集中在大氣降塵的理化性質(zhì)、傳輸機制、時空分布、環(huán)境效應等方面，對其生物組分特性了解較少［7］.

凱里作為全國優(yōu)秀旅游城市，環(huán)境空氣質(zhì)量優(yōu)良天數(shù)常年名列前茅.隨著一系列大氣污染物控制措施及各種相關(guān)政策落實，顆粒物現(xiàn)已成為城區(qū)的首要污染物.本研究主要通過收集典型的城區(qū)（凱里市中心）、工業(yè)區(qū)（爐山工業(yè)園）、清水江邊降塵顆粒物樣品，分析凱里市大氣降塵顆粒物中的微生物組成、濃度及分布特征，在此基礎(chǔ)上，通過比對致病菌株數(shù)據(jù)庫分析大氣降塵顆粒物中的病原微生物組分，為該地區(qū)環(huán)境治理及環(huán)境質(zhì)量評價提供數(shù)據(jù)支撐.

1 材料與方法

1.1 降塵顆粒物的采集

大氣降塵微生物群落組成并不穩(wěn)定，很容易受到周圍各種環(huán)境因素和其他因素的影響，導致其微生物群落發(fā)生改變，特別是氣候因素，基于上述考慮，本研究選擇在3 月初，微風時期進行樣品采集.根據(jù)降塵顆粒物的不同來源進行分區(qū)采集樣品，采樣高度距地面1～2 m，采集的位置主要包括公路邊的電線桿、公交站臺、建筑樓以及窗臺.用毛筆刷將不同位置采集到的降塵通過濾紙掃到滅菌好的玻璃瓶中，由于受到實驗條件和經(jīng)費的限制，將該地區(qū)采集的樣品進行混合鑒定.對城區(qū)、工業(yè)園區(qū)和清水江畔3區(qū)域選取采樣點信息如下所述.

凱里市城區(qū)各街道均有人流量大、交通密集、大型建筑多的特點.根據(jù)其交通、人群、植物、食品、建筑、綠化等情況，隨機選擇5 個采樣點，分別是西門中學（26°35′21″N，107°58′19″E）、凱運司（26°35′10″N，107°58′41″E）、蘋果山（26°35′11″N，107°58′44″E）、州醫(yī)院（26°34′59″N，107°58′31″E）和體育館（26°34′14″N，107°58′26″E）采樣點.

工業(yè)園區(qū)的道路旁（26° 38′35″N，107°46′40″E）、重工業(yè)區(qū)（26°38′26″N，107°46′42″E）和廣場（26°38′35″N，107°46′25″E）3個區(qū)域.

清水江畔（下司至鐮刀灣段）有下司（26°31′3″N，17°48′30″E）、鐮刀灣（26°31′38″N，107°52′47″E）.

1.2 LB培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基組成如下：蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，瓊脂20，調(diào)整pH 為7.2，并加入去離子水定容至1 L.

1.3 降塵細菌培養(yǎng)、分離與計數(shù)

將城區(qū)、工業(yè)園區(qū)和清水江畔采集到的降塵樣品各稱取1 g，置于無菌玻璃瓶中，然后加入5 mL 的無菌水放入搖床均勻振蕩30 min 后再靜置20 min.在超凈工作臺，經(jīng)適度梯度稀釋后（100、10-1、10-2，、…、10-7）后，取稀釋液200 μL 涂布平板，然后置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24～48 h，觀察培養(yǎng)皿中不同濃度微生物的生長情況，選取菌落數(shù)量在30～300 個的平板進行菌落計數(shù)，并根據(jù)公式a*5/10-n（a：菌落個數(shù)；n：稀釋梯度）計算樣品中細菌濃度（CFU/g）.所有實驗設(shè)置3 重復，盡量減少隨機誤差造成的影響.

1.4 16S rRNA基因測序進行微生物分類鑒定

1.4.1 菌落PCR擴增16S rRNA基因

DNA 模板制備：用牙簽從培養(yǎng)后的平板上隨機挑取菌落加入到裝有50 μL 無菌水的1.5 mL 離心管中，然后采用熱激冷凍方法，進行細胞破碎，使細菌DNA 分子破裂釋放出水溶液中.具體操作如下：將離心管先放入100℃水浴鍋中加熱5 min，立即轉(zhuǎn)移至冰水混合物中冰浴5 min，重復上述過程2次，最后12000 r/min離心2 min后備用.

50 μL PCR 擴增體系：2×Taq Master Mix（大連寶生物公司）25 μL，10 μM 27F 引物1 μL，10 μM 1492R引物1μL，DNA模版2μL，ddH2O補足21μL.

PCR 擴增程序：預變性98℃2 min；29 個循環(huán)（變性94℃10 s，退火45℃10 s，延伸72℃1.5 min）；72℃5 min；降溫25℃5 min；4 ℃保存.

1.4.2 PCR擴增檢測及測序

PCR 產(chǎn)物使用1%（M/V）瓊脂糖凝膠電泳進行分析，然后送至賽默飛世爾科技（中國）有限公司（廣州）進行純化及16S rRNA基因測序.

1.4.3 序列分析

將測序結(jié)果批量提交至美國國立生物信息技術(shù)與中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）16S rRNA基因數(shù)據(jù)庫進行BLASTN（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比對分析，并以同源性最高序列（總分最高）作為參照菌株，確定所分析菌落的分類關(guān)系.

1.5 致病菌株分析

根據(jù)報道的致病菌株數(shù)據(jù)庫［8］，確定致病菌類別.

2 結(jié)果與分析

2.1 降塵顆粒物中可培養(yǎng)細菌濃度

經(jīng)過LB培養(yǎng)基按濃度梯度培養(yǎng)后，觀察降塵顆粒物菌落培養(yǎng)皿中不同梯度稀釋度涂布平板的生長情況，選取平板中菌株數(shù)在30～300的培養(yǎng)皿進行菌落計數(shù)，然后對多次計算結(jié)果平均值隨機計數(shù)菌落數(shù)量得出3個區(qū)域樣品中可培養(yǎng)微生物濃度從高到低分別為：城區(qū)3.7×107CFU/g，清水江畔3.3×106CFU/g，工業(yè)區(qū)8.5×105CFU/g.城區(qū)作為黔東南州中心，人口相對于后兩者密集，交通流量大，初步推斷，該區(qū)域的降塵顆粒物濃度受人類活動影響較大.

2.2 沉降微生物種類

隨機挑取182 個菌株（其中城區(qū)樣品62 個、工業(yè)園區(qū)樣品60 個、清水江畔60 個）進行16S rRNA基因分析，并將獲得的119 個陽性PCR 產(chǎn)物（其中城區(qū)樣品40 個、工業(yè)園區(qū)樣品37 個、清水江畔42個）進行測序.以BLAST 比對結(jié)果最高得分和最大相似度來確定該細菌的屬名，結(jié)果如表1 所示.從凱里市區(qū)沉降中鑒定到的細菌包括芽孢桿菌屬（Bacillus）、節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）、考克氏菌屬（Kocuria）和兩面神菌屬（Janibacter）等12 種菌屬，其中芽孢桿菌屬（22.5%）和節(jié)桿菌屬（17.5%）為主要優(yōu)勢菌屬（圖1）；從爐山工業(yè)園區(qū)分離到馬賽菌屬（Massilia）、弗里戈里氏菌屬（Friedrichia）、冰凍小桿菌屬（Frigoribacterium）和副球菌屬（Paracoccus）等5 個屬，其中馬賽菌屬為優(yōu)勢菌占，比例高達86.5%（圖1）；從清水江畔區(qū)域降塵顆粒物中鑒定到微桿菌屬（Microbacterium）、芽孢桿菌和考克氏菌屬等15個屬菌株，其中微桿菌屬占42.85%，為主要優(yōu)勢菌屬（圖1）.

表1 119株細菌16S rRNA基因序列分析結(jié)果一覽表

續(xù)表1 119株細菌16S rRNA基因序列分析結(jié)果一覽表

續(xù)表1 119株細菌16S rRNA基因序列分析結(jié)果一覽表

圖1 凱里市3個典型區(qū)域沉降中微生物種類及豐度

2.3 致病微生物種類

經(jīng)比對人類致病微生物數(shù)據(jù)庫，沉降中包括有芽孢桿菌（Bacillus）、棒狀桿菌（Corynebacterium）、假單胞菌（Pseudomonas）和葡萄球菌（Staphylococcus）等潛在致病菌屬，特別是最后兩類細菌可能會引起氣管炎、肺炎和敗血癥等.這些潛在致病菌主要分布在城區(qū)和清水江畔.

3 討論

本研究采用可培養(yǎng)方法并結(jié)合16S rRNA 基因分子鑒定方法，對凱里市城區(qū)、工業(yè)園區(qū)和清水江畔3個典型區(qū)域大氣沉降中微生物進行培養(yǎng)、純化分離及種屬鑒定，來深入了解凱里市大氣沉降顆粒物中可培養(yǎng)微生物群落結(jié)構(gòu)特征.結(jié)果顯示不同區(qū)域的微生物群落存在一定差異，凱里城區(qū)的微生物濃度含量最高，爐山工業(yè)園區(qū)最低；此外，不同區(qū)域沉降中可培養(yǎng)微生物種類存在差異，與城區(qū)和工業(yè)園區(qū)相比較，清水江畔沉降細菌種類屬數(shù)量最高.3 個區(qū)域細菌群體豐度和種類差異可能是由不同區(qū)域的地理氣候等環(huán)境差異所致.城區(qū)人口密集，機動車輛流動大，因而可能攜帶更多微生物，最終進入大氣沉降中；清水江沿岸植被覆蓋率和水含量較高，并且受人類活動影響相對較小，合適的氣候、水分和溫度等環(huán)境更加適應于各種類型細菌生長繁殖，因此微生物種類相對較多；爐山工業(yè)園區(qū)大多是工廠，人流量小，這些因素可能導致微生物種類偏少.

凱里城區(qū)和清水江畔含有芽孢桿菌屬、微桿菌屬、節(jié)桿菌屬且含量占比都較高，這與曲浩麗等人［9-10］在研究南京市大氣降塵固碳微生物群落多樣性和南京市春季不同功能區(qū)大氣微生物群落結(jié)構(gòu)分析中相一致，測出的芽孢桿菌屬、微球菌屬等為優(yōu)勢菌屬.爐山工業(yè)園區(qū)檢測出的菌屬中與其他兩個區(qū)域的菌種完全不同，并且種類少，發(fā)生這種原因很有可能是實驗過程中挑取菌株的隨機性不夠或其他菌落不適合在LB 培養(yǎng)基中生長培養(yǎng)［11］.馬賽菌屬在工業(yè)園區(qū)中占絕對優(yōu)勢，這可能與該屬菌株廣泛分布于土壤、水體、空氣中且環(huán)境耐受性較強，能夠穩(wěn)定吸附在空氣顆粒物中并以氣溶膠形式懸浮于大氣等因素有關(guān)［12］.

目前人類可培養(yǎng)的微生物種類不到微生物總數(shù)的1%［13-14］，并且不同微生物對營養(yǎng)組分和生長環(huán)境需求差異大，因此本研究采用LB 培養(yǎng)基進行可培養(yǎng)法，并不能完整反映該地區(qū)的微生物群落結(jié)構(gòu)總體情況.后續(xù)將采用16S rRNA 基因高通量測序方法來進一步解析黔東南州地區(qū)大氣沉降微生物群落，為深入認識空氣質(zhì)量較好區(qū)域大氣顆粒物微生物組分提供有用信息.