周 茁，曹衛(wèi)宇，奚世超

(上海化工研究院有限公司 上海 200062)

青霉素及頭孢屬于β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素，7-ACA是頭孢菌素的中間體，此類(lèi)抗生素具有殺菌活性強(qiáng)、毒副作用小等特點(diǎn)，在動(dòng)物飼養(yǎng)過(guò)程中的應(yīng)用非常普遍[1-3]。隨著其在臨床上的應(yīng)用研究和毒理學(xué)研究的深入，由其殘留引起的安全問(wèn)題已不容忽視，故β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物在不同介質(zhì)中的痕量檢測(cè)引起了廣泛的關(guān)注。降解后的抗生素藥渣經(jīng)測(cè)定抗生素含量低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求后，可資源化利用生產(chǎn)肥料。對(duì)不同介質(zhì)中青霉素及7-ACA殘留的分析方法有傳統(tǒng)的微生物法[4]、HPLC-UV法[5-6]、HPLC-FD法[7-8]及LC-MS/MS法[9-10]，其中高效液相色譜法最大的優(yōu)點(diǎn)是測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確度高，但每次檢測(cè)的開(kāi)機(jī)費(fèi)用較昂貴?！吨腥A人民共和國(guó)獸藥典》(1990年版)采用碘量法測(cè)定青霉素含量，即青霉素經(jīng)堿水解生成青霉噻唑酸后與碘作用，根據(jù)碘的消耗量測(cè)得青霉素含量。該方法不僅適用于青霉素含量的測(cè)定，也適用于與青霉素結(jié)構(gòu)類(lèi)似的頭孢類(lèi)藥物的測(cè)定，其最大的優(yōu)點(diǎn)是采用常規(guī)的檢測(cè)儀器及設(shè)備即可獲得令人滿意的測(cè)定結(jié)果。為此，探索了碘量法測(cè)定青霉素及7-ACA的相關(guān)條件，并驗(yàn)證該方法的精密度及準(zhǔn)確度，以期為藥渣中抗生素的檢測(cè)提供科學(xué)的依據(jù)和可靠的方法。

1 試驗(yàn)部分

1.1 反應(yīng)原理

7-ACA及青霉素母核6-APA不能直接與碘反應(yīng)，必須經(jīng)堿水解后打開(kāi)內(nèi)酰胺環(huán)，才能與碘反應(yīng)；待6-APA和7-ACA與碘反應(yīng)完全以后，用標(biāo)準(zhǔn)的硫代硫酸鈉溶液滴定過(guò)量的碘液，由消耗的標(biāo)準(zhǔn)硫代硫酸鈉溶液的體積求出7-ACA和青霉素的含量。6-APA碘量法反應(yīng)方程式如式(1)、式(2)和式(5)所示，7-ACA碘量法反應(yīng)方程式如式(3)、式(4)和式(5)所示。

(1)

(2)

(3)

(4)

2Na2S2O3+I2=Na2S4O6+2NaI

(5)

1.2 主要儀器與試劑

主要儀器：分析天平、容量瓶、碘量瓶、滴定管、移液管等。

主要試劑：青霉素G原藥(芐青霉素鈉)，內(nèi)蒙古常盛制藥有限公司標(biāo)品；7-ACA原藥，伊犁川寧制藥有限公司標(biāo)品；0.009 748 mo/L碘液、0.011 72 mol/L硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液、淀粉指示劑、1 mol/L HCl溶液、1 mol/L NaOH溶液、醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH=4.5)。

1.3 試驗(yàn)步驟

(1)精密稱(chēng)取供試樣品約100 mg于250 mL容量瓶中，加去離子水稀釋至刻度。

(2)用移液管吸取一定體積(V0)的試樣溶液于碘量瓶中，加入一定量的1 mol/L NaOH溶液，放置一定時(shí)間后加入與1 mol/L NaOH溶液等體積的1 mol/L HCl溶液、5 mL醋酸-醋酸鈉緩沖液和一定量的0.009 748 mol/L碘液于碘量瓶中并密塞，在常溫下暗處放置一定時(shí)間后，用0.011 72 mol/L硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，至近終點(diǎn)時(shí)加入淀粉指示劑，繼續(xù)滴定至藍(lán)色消失。

(3)另取與V0等體積的去離子水置于碘量瓶中，加5 mL醋酸-醋酸鈉緩沖液和一定量的0.009 748 mol/L碘液，用0.011 72 mol/L硫代硫酸鈉滴定，作為空白。

1.4 計(jì)算公式

青霉素和7-ACA質(zhì)量分?jǐn)?shù)按式(6)和式(7)計(jì)算：

(6)

(7)

式中：V空白——對(duì)照空白消耗Na2S2O3的體積，mL；

VNa2S2O3——樣品消耗Na2S2O3的體積，mL；

CNa2S2O3——硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液物質(zhì)的量濃度，mol/L；

M青霉素——青霉素的分子量；

M7-ACA——7-ACA的分子量；

m稱(chēng)樣量——樣品質(zhì)量，g；

R校正系數(shù)——實(shí)際含量與測(cè)定含量之比；

V0——吸取試樣的體積，mL。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同測(cè)定條件對(duì)7-ACA含量測(cè)定結(jié)果的影響

當(dāng)采用碘量法測(cè)定青霉素含量時(shí)，在常溫下吸取一定量的試樣溶液，加入1 mL的1 mol/L NaOH溶液，放置0.5 h，再加入與1 mol/L NaOH溶液等體積的1 mol/L鹽酸溶液、5 mL醋酸-醋酸鈉緩沖液和10 mL碘液后放置0.5 h，測(cè)得的青霉素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為91.25%?？紤]到青霉素原藥中本身含有一定的雜質(zhì)，測(cè)定值與實(shí)際值接近，所以無(wú)需對(duì)青霉素的測(cè)試條件進(jìn)行優(yōu)化，故青霉素計(jì)算公式中的校正系數(shù)為1。采用碘量法分析測(cè)定7-ACA時(shí)，其分子結(jié)構(gòu)中的內(nèi)酰胺環(huán)[11]完全打開(kāi)是保證分析結(jié)果準(zhǔn)確的必要條件。由于7-ACA中的內(nèi)酰胺環(huán)比青霉素中的內(nèi)酰胺環(huán)結(jié)構(gòu)更為穩(wěn)定，要求既要確保7-ACA中的內(nèi)酰胺環(huán)完全打開(kāi)，又要保證7-ACA中其他結(jié)構(gòu)不發(fā)生變化，因此需考察堿解開(kāi)環(huán)時(shí)間、堿解開(kāi)環(huán)反應(yīng)溫度、NaOH加入量以及已開(kāi)環(huán)7-ACA的碘氧化反應(yīng)時(shí)間等因素對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。

2.1.1 堿解開(kāi)環(huán)時(shí)間對(duì)7-ACA含量測(cè)定結(jié)果的影響

如圖1所示，加入1 mol/L NaOH溶液后，7-ACA含量的測(cè)定結(jié)果隨堿解開(kāi)環(huán)時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。其原因可能是隨著堿解時(shí)間的延長(zhǎng)，7-ACA的內(nèi)酰胺環(huán)不斷被打開(kāi)，碘與開(kāi)環(huán)的內(nèi)酰胺環(huán)發(fā)生氧化反應(yīng)，但放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)引起碘揮發(fā)，導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果偏低。因此，最佳堿解開(kāi)環(huán)時(shí)間為1 h。

圖1 堿解開(kāi)環(huán)時(shí)間對(duì)7-ACA含量測(cè)定結(jié)果的影響

2.1.2 堿解開(kāi)環(huán)反應(yīng)溫度對(duì)7-ACA含量測(cè)定結(jié)果的影響

如圖2所示，7-ACA含量的測(cè)定結(jié)果隨堿解開(kāi)環(huán)反應(yīng)溫度的升高而降低。其原因是溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致碘的揮發(fā)，同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致7-ACA中被氧化的結(jié)構(gòu)發(fā)生降解。因此，最佳堿解開(kāi)環(huán)反應(yīng)溫度應(yīng)在30 ℃以內(nèi)。

圖2 堿解開(kāi)環(huán)反應(yīng)溫度對(duì)7-ACA含量測(cè)定結(jié)果的影響

2.1.3 NaOH加入量對(duì)7-ACA含量測(cè)定結(jié)果的影響

如圖3所示，7-ACA含量的測(cè)定結(jié)果隨1 mol/L NaOH溶液加入量的增加呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，表明適度增加NaOH的加入量有利于堿解開(kāi)環(huán)反應(yīng)，但NaOH溶液加入量過(guò)多反而會(huì)抑制堿解開(kāi)環(huán)反應(yīng)的進(jìn)行。因此，1 mol/L NaOH溶液加入量以8 mL為宜。

圖3 NaOH加入量對(duì)7-ACA含量測(cè)定結(jié)果的影響

2.1.4 碘氧化反應(yīng)時(shí)間對(duì)7-ACA含量測(cè)定結(jié)果的影響

如表1所示，在其他條件一定的情況下，加入碘0.5 h后，碘已與開(kāi)環(huán)后的7-ACA充分反應(yīng)，繼續(xù)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間對(duì)測(cè)定結(jié)果影響不大。因此，加入碘后最佳的放置時(shí)間為0.5 h。

表1 碘氧化反應(yīng)時(shí)間對(duì)7-ACA含量測(cè)定結(jié)果的影響

綜上所述，測(cè)定7-ACA的最佳條件為：稱(chēng)取0.1 g左右的7-ACA定容至250 mL容量瓶中；吸取一定量的試樣溶液，先加入8 mL的1 mol/L NaOH溶液于常溫下放置1.0 h，然后依次加入與1 mol/L NaOH溶液等體積的1 mol/L HCl溶液、5 mL醋酸-醋酸鈉緩沖液和10 mL碘液，繼續(xù)放置0.5 h后用0.011 72 mol/L硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定。在此最佳條件下測(cè)得7-ACA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為116.79%，其實(shí)際值為100.00%，故R校正系數(shù)=1/1.17。

2.2 回收率試驗(yàn)

精密配制青霉素G、青霉素V和7-ACA溶液，質(zhì)量濃度分別為0.60、0.80和1.00 g/L，采用碘量法測(cè)定各樣品溶液，每個(gè)樣品進(jìn)行2次平行測(cè)定并計(jì)算回收率，試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果表明，采用碘量法測(cè)定不同質(zhì)量濃度的青霉素G、青霉素V及7-ACA，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確度良好，均接近實(shí)際值。

2.3 精密度試驗(yàn)

分別稱(chēng)取一定質(zhì)量的青霉素G和7-ACA溶于水中，按上述碘量法進(jìn)行4次平行測(cè)定，結(jié)果(表3)表明該方法精密度良好、重現(xiàn)性較高。

表3 精密度試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)語(yǔ)

通過(guò)試驗(yàn)，對(duì)碘量法測(cè)定青霉素及7-ACA的測(cè)定條件進(jìn)行了探索。測(cè)定7-ACA的最優(yōu)條件：在一定量的試樣溶液中加入8 mL的1 mol/L NaOH溶液并于常溫下放置1.0 h，然后加入與1 mol/L NaOH溶液等體積的1 mol/L鹽酸溶液、5 mL醋酸-醋酸鈉緩沖液和10 mL碘液，繼續(xù)放置0.5 h后用0.011 72 mol/L標(biāo)準(zhǔn)硫代硫酸鈉溶液滴定。測(cè)定青霉素的最優(yōu)條件：在一定量的試樣溶液中加入1 mL的1 mol/L NaOH溶液并于常溫下放置0.5 h，然后加入與1 mol/L NaOH溶液等體積的1 mol/L鹽酸溶液、5 mL醋酸-醋酸鈉緩沖液和10 mL碘液，繼續(xù)放置0.5 h后用0.011 72 mol/L標(biāo)準(zhǔn)硫代硫酸鈉溶液滴定。在最優(yōu)試驗(yàn)條件下采用碘量法對(duì)青霉素及7-ACA進(jìn)行測(cè)定時(shí)，藥物回收率及精密度均良好。