崔春雨，楊宇婷，肖 麗，李 青

(河南師范大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，河南 新鄉(xiāng) 453007)

綠原酸具有多種生物活性[1-2]，是眾多中藥藥材、飲片以及中成藥的主要有效成分，有很大的市場(chǎng)需求和藥用前景。綠原酸在多種植物中存在，但其在忍冬科忍冬屬(Lonicera)中含量較多。綠原酸是判斷金銀花質(zhì)量的重要指標(biāo)之一[3]。綠原酸的提取方法有很多，目前主要有石硫醇法[4]、大孔樹脂吸附[5]、雙水相萃取法[6]、超臨界流體萃取法[7]等多種方法。綠原酸化學(xué)性質(zhì)較不穩(wěn)定，目前其分離純化工藝主要是柱層析法，存在著工藝復(fù)雜、能耗大、提取率低等問題。因此，尋找成本較低、操作簡(jiǎn)單、可工業(yè)化生產(chǎn)的綠原酸分離純化工藝具有很大的價(jià)值。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料和儀器

主要儀器: Waters 600 高效液相色譜儀，Waters 2487 檢測(cè)器，C18色譜柱(安捷倫，4. 6 mm×250 mm，5μm)。

試劑:甲醇、乙腈(色譜純，天津四友公司)；乙酸乙酯、乙醇、硫酸銨(分析純，西隴化工股份有限公司)；綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品(上海晶純?cè)噭┯邢薰?，產(chǎn)品批號(hào)1313098)。

1.2 實(shí)驗(yàn)過程

1.2.1 金銀花浸膏水溶液的制備

稱取1000g的金銀花，粉碎后加入4000mL乙醇水溶液(乙醇體積百分比為60%)，加10%鹽酸調(diào)節(jié)pH值=5左右，超聲波輔助浸提3次，每次時(shí)間為1h，合并浸提液，減壓蒸餾濃縮成浸膏，加去離子水制成500mL金銀花浸膏水溶液，備用。

1.2.2 綠原酸的富集

采用液液萃取方法，用有機(jī)溶劑選擇性萃取以實(shí)現(xiàn)綠原酸的初步富集。乙酸乙酯可以從金銀花浸膏水溶液中萃取出少量綠原酸，通過多次萃取，大部分綠原酸還是分配于水相中，因此，金銀花浸膏水溶液通過乙酸乙酯萃取除去極性小于綠原酸的雜質(zhì)。然后，乙醇中加入恰當(dāng)比例的乙酸乙酯降低其極性，作為混合有機(jī)溶劑選擇性萃取綠原酸。利用無機(jī)鹽/親水有機(jī)溶劑雙水相體系萃取原理[8]。浸膏水溶液中加入適量硫酸銨，促使乙醇與浸膏水溶液相分層。本實(shí)驗(yàn)在金銀花浸膏水溶液中加入硫酸銨固體，通過V(乙醇)∶V(乙酸乙酯)=9∶91選擇性萃取富集綠原酸。

取50mL金銀花浸膏水溶液，加入4g硫酸銨固體，攪拌溶解，用等體積的體積百分?jǐn)?shù)為9%的乙醇-乙酸乙酯萃取8次即可將大部分綠原酸萃出，合并8次萃取液成400 mL，分成4等份，每份100mL。分別將為2，3，4，5g的活性炭裝入層析柱，在常溫常壓條件下，將4份萃取液過活性炭柱進(jìn)行吸附脫色。

1.2.3 綠原酸的分離純化

經(jīng)活性炭吸附后的乙醇-乙酸乙酯萃取液經(jīng)減壓蒸餾濃縮得到綠原酸粗品。綠原酸粗品經(jīng)混合溶劑V(乙酸乙酯)∶V(甲醇)=3∶2進(jìn)行重結(jié)晶，得到綠原酸白色粉末狀晶體。

1.3 高效液相色譜法測(cè)定綠原酸含量

1.3.1 色譜條件

柱溫:30℃;流動(dòng)相∶乙腈∶0.4%磷酸溶液(11∶89);流速:1.0mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)326nm。

1.3.2 線性關(guān)系的考察

精密稱取綠原酸對(duì)照品，加30%甲醇稀釋溶解配制為濃度為0.02，0.04，0.06，0.08，0.1，0.12，0.14 mg·mL-1溶液。分別吸取以上對(duì)照品濃度各10μL注入液相色譜儀。以峰面積值為縱坐標(biāo),對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，得回歸方程為Y=5×107X+32076,相關(guān)系數(shù)R2=0.9996。結(jié)果表明，綠原酸進(jìn)樣量在0.02～0.14mg·mL-1范圍內(nèi)，峰面積跟濃度線性關(guān)系良好。

1.3.3 測(cè)定供試品綠原酸含量

取萃取后上下相溶液各1mL用流動(dòng)相稀釋定容至100mL，然后再取上述溶液1mL用流動(dòng)相稀釋至100mL，用高效液相色譜儀測(cè)定時(shí)進(jìn)樣量為10μL，測(cè)定峰面積值。

2 結(jié)果和討論

2.1 萃取體系的選擇

考察硫酸銨水溶液與乙醇-乙酸乙酯混合溶劑形成液-液雙相平衡體系的質(zhì)量濃度?；旌先軇┮宜嵋阴ズ鸵掖嫉谋壤龥Q定了硫酸銨的質(zhì)量濃度，如表1所示：

表1 不同體積比乙醇-乙酸乙酯跟等體積水分層所需硫酸銨用量Table 1 The quality of ammonium sulfate cause to layered between different ratio of ethanol and ethyl acetate and the isovolumetricwater

2.2 混合萃取溶劑乙醇-乙酸乙酯比例的確定

取350mL金銀花浸膏水溶液，先用乙酸乙酯等體積萃取6次去除極性小于綠原酸的雜質(zhì)，再將浸膏水溶液分成7份，每份50mL，加入硫酸銨固體，使浸膏水溶液中硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%,6%,8%,10%,13%,15%，再依照順序用體積比為3∶97,6∶94,9∶91,12∶88,15∶85,18∶82的乙醇-乙酸乙酯混合溶劑對(duì)金銀花浸膏水溶液進(jìn)行萃取，其中乙醇-乙酸乙酯(18∶82)作為萃取劑時(shí)，上相萃取液經(jīng)薄層色譜法檢測(cè)可知含有部分紫外不顯色、極性大于綠原酸的雜質(zhì)，這些雜質(zhì)影響綠原酸的純化結(jié)晶，所以該體積比乙醇-乙酸乙酯不作具體考察。通過高效液相色譜法“1.3.3”節(jié)檢測(cè)分析萃取體系上下相中綠原酸峰面積、雜質(zhì)分配情況、萃取率等，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2[9]所示：

表2 不同體積比的乙醇-乙酸乙酯對(duì)綠原酸萃取效果Table 2 The results of different volume ratio of ethyl acetate and methanol on chlorogenic acid

根據(jù)表2可知：隨著乙醇-乙酸乙酯中乙醇體積比的增加，綠原酸在有機(jī)相中的含量逐漸增大。同時(shí)，雜質(zhì)在上下相中的比例也在不斷增大。以雜質(zhì)1和雜質(zhì)2為例，當(dāng)乙醇-乙酸乙酯體積比為12∶88和15∶85時(shí)，雜質(zhì)1和雜質(zhì)2在上相中增幅較大。大量雜質(zhì)會(huì)對(duì)綠原酸的純化結(jié)晶過程造成較大影響。因此，選擇乙醇-乙酸乙酯(9∶91)作為作為萃取溶劑。等體積萃取8次時(shí)，綠原酸在上下相中達(dá)到平衡。在常溫常壓條件下，合并8次萃取液共400mL，分成4等份，分別通過2，3，4，5g的活性炭吸附脫色。

綜合考慮脫色效果及對(duì)綠原酸的吸附量，活性炭用量為0.03g·mL-1時(shí)效果較好。脫色后的乙醇-乙酸乙酯萃取液經(jīng)減壓蒸餾濃縮得到綠原酸粗品，再用V(乙酸乙酯)∶V(甲醇) =3∶2混合溶劑重結(jié)晶得到白色粉末狀綠原酸晶體。

2.3 重復(fù)試驗(yàn)

取100 mL金銀花浸膏水溶液，用等體積乙酸乙酯萃取6次以去除雜質(zhì)，于金銀花浸膏水溶液中加入8g硫酸銨，攪拌至溶解，再用等體積V(乙醇)∶V(乙酸乙酯)=9∶91萃取8次，合并8次萃取液共800mL，通過裝入量為24g的活性炭柱吸附脫色，脫色后萃取液經(jīng)減壓蒸餾得綠原酸粗品約2.95g，經(jīng)V(乙酸乙酯)∶V(甲醇)=3∶2溶劑重結(jié)晶得2.05g綠原酸晶體，最終產(chǎn)物純度為98.63%，金銀花浸膏水溶液中綠原酸含量為2.8%，萃取率為36.63%。

2.4 結(jié)構(gòu)鑒定

分離得到白色結(jié)晶，其MS、IR、1HNMR、CNMR等各項(xiàng)數(shù)據(jù)如下：

mp:208～209℃，分子式為C16H18O9，分子量為354。IR (KBr) v/cm-1:3355，2954,2925,2985,2360,2341,1727,1704,1687,1639,1384,1288,1186,1085,816。1HNMR(DMSO-d6, 300 MHz)，δ:7.45(1H,d,J=15.6Hz,H-β),7.04(1H,d,J=1.8Hz,H-2′), 6.98(1H,dd,J=8.4,1.8Hz,H-6′), 6.77(1H,d,J=8.4Hz,H-5′),6.15 (1H,d,J=15.6Hz,H-α),5.07(1H,m,H-3),4.78(1H,m,H-5),3.56(1H,dd,J=8.4,3.0Hz,H-4),2.06～1.757(4H,m,H-2,6)。13CNMR(DMSO-d6,300 MHz)，δ:175.4(COOH),166.2(C=O),148.8(C-β),114.73(C-α),126.0(C-1′),121.8(C-2′),145.4(C-3′),148.8(C-4′),115.2(C-5′), 121.8(C-2′), 73.92 (C-1), 37.6(C-2), 71.3(C-3), 70.8(C-4),68.5(C-5),36.7(C-6)。

3 結(jié)語

通過乙醇-乙酸乙酯混合有機(jī)溶劑選擇性萃取技術(shù)替代傳統(tǒng)的柱層析分離方法，達(dá)到了富集綠原酸的目的，然后再通過活性碳吸附除雜和重結(jié)晶即得到了綠原酸，其純度達(dá)到98.63%，且萃取率為36.63%。此方法建立一種液液萃取法分離高效分離綠原酸的方法，與傳統(tǒng)柱色譜法相比，生產(chǎn)成本低、工藝簡(jiǎn)單，有利于工業(yè)生產(chǎn)。