陳衛(wèi)剛，包瑩瑩，何玉琴，*，葛聞博，張 霞，華道才讓，楊大鵬，周凱仁

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 甘肅 蘭州 730070； 2.甘肅省甘南藏族自治州夏河縣甘加鄉(xiāng)畜牧獸醫(yī)工作站，甘肅 夏河 747199)

哺乳動(dòng)物的生殖活動(dòng)以下丘腦-垂體-性腺軸(hypothalamic-pituitary-gonadal axis，HPGA)為主導(dǎo)，相互協(xié)調(diào)有規(guī)律地進(jìn)行著復(fù)雜的繁殖生理活動(dòng)過程[1-2]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，哺乳動(dòng)物KISS-1基因能調(diào)節(jié)下丘腦促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone，GnRH)的釋放，進(jìn)而促進(jìn)促卵泡素(FSH)和促黃體素(LH)的分泌[3-4]，影響初情期啟動(dòng)、季節(jié)性繁殖、發(fā)情周期、排卵、妊娠和泌乳等生殖活動(dòng)[5-13]。GPR54作為Kisspeptin的特異性受體，在KISS-1/GPR54系統(tǒng)對(duì)動(dòng)物生殖生理調(diào)控中起到不可或缺的作用。Funes等[14]運(yùn)用基因打靶手段敲除雌性和雄性小鼠的GPR54基因，發(fā)現(xiàn)雄性小鼠表現(xiàn)為睪丸和輸精管發(fā)育不完全，雌性小鼠基本喪失生育功能。對(duì)遺傳背景相同的小鼠進(jìn)行KISS-1和GPR54基因敲除，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，KISS-1敲除小鼠表型的嚴(yán)重程度要低于GPR54敲除小鼠表型，但都具有一定程度的變異性。大量研究結(jié)果都揭示了Kisspeptin必須與GPR54結(jié)合后才能發(fā)揮其生物學(xué)作用[15]。但KISS-1/GPR54對(duì)動(dòng)物生殖活動(dòng)過程調(diào)控功能和機(jī)理研究相對(duì)較少，其對(duì)動(dòng)物發(fā)情周期各階段的調(diào)控機(jī)理研究鮮有報(bào)道。高原甘加藏羊是季節(jié)性發(fā)情動(dòng)物，生活在海拔3 000 m以上的高寒牧區(qū)，具有抗高寒、抗逆性、遺傳性穩(wěn)定等種質(zhì)特性，因此研究其生殖生理特性對(duì)藏區(qū)畜牧業(yè)發(fā)展具有重要意義。目前有關(guān)KISS-1/GPR54對(duì)高原甘加藏羊發(fā)情周期等生殖活動(dòng)的影響及其調(diào)控機(jī)理研究未見報(bào)道。本研究首次對(duì)甘加藏羊發(fā)情周期各時(shí)期HPO中KISS-1/GPR54表達(dá)和分布變化進(jìn)行了研究，以揭示KISS-1/GPR54對(duì)藏羊季節(jié)性發(fā)情及發(fā)情周期等繁殖生理活動(dòng)的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

在藏羊的繁殖季節(jié)(7—9月)，于甘肅甘南甘加鄉(xiāng)羊場(chǎng)選擇年齡2.5～3.5歲健康且空懷的雌性甘加藏羊32只，按照發(fā)情周期的4個(gè)時(shí)期分為4組，每組8只，采取自由放牧，跟蹤觀察2個(gè)發(fā)情周期后開始取樣。根據(jù)公羊試情結(jié)合母羊陰道涂片法鑒定其發(fā)情狀況，分別在發(fā)情前期、發(fā)情期、發(fā)情后期、間情期，將其頸部局部麻醉后進(jìn)行頸動(dòng)脈放血無痛處死(符合國家有關(guān)動(dòng)物倫理動(dòng)物福利方面的相關(guān)規(guī)定)，迅速打開顱腔和腹腔，完整取出下丘腦、垂體及卵巢軸組織，各組織均等分為2份，分別置于液氮和4%多聚甲醛固定液保存，液氮中組織速凍后移至-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總RNA提取與實(shí)時(shí)熒光定量PCR

嚴(yán)格按照TRIzol試劑(Invitrogen，美國)總RNA提取試劑盒說明書，提取各組織總RNA。提取到的RNA經(jīng)超微量核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)濃度和純度。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所得RNA完整性，可清晰看到28S、18S和5S條帶。反轉(zhuǎn)錄嚴(yán)格按照購買的cDNA反轉(zhuǎn)錄合成試劑盒(全式金，北京)說明進(jìn)行操作。

利用NCBI查找綿羊的KISS-1、GPR54和β-actin基因序列，運(yùn)用Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物(表1)，由上海生工生物科技有限公司合成。

以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)分析。總反應(yīng)體系為20 μL：模板1 μL，上、下游引物各0.5 μL，2×TransStart TiP Green qPCR SuPerMix 10 μL，ddH2O 8 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃ 5 s，60 ℃退火30 s，循環(huán)次數(shù)45次，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所得相關(guān)數(shù)據(jù)用2-ΔΔCt方法計(jì)算，每個(gè)基因表達(dá)量均以β-actin內(nèi)參基因進(jìn)行校正。所有數(shù)據(jù)用SPSS17.0軟件進(jìn)行方差和顯著性分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

1.4 下丘腦-垂體-卵巢軸組織Kisspeptin、GPR54分布的免疫組織化學(xué)染色分析

石蠟切片脫蠟處理后，利用H2O2孵育10 min，封閉內(nèi)源性過氧化物酶，后利用過氧化物標(biāo)記的鏈霉卵白素(streptavidin/peroxidase，SP)法進(jìn)行染色。Kisspeptin和GPR54抗體(博奧森， 北京)以1∶400稀釋，陰性對(duì)照用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)代替一抗，4 ℃孵育過夜，然后與二抗(博奧森，北京)室溫反應(yīng)10 min后用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)(博奧森，北京)顯色，脫水透明后用中性樹膠封片。利用BX51-DP71(麥克奧迪，日本)正置光學(xué)顯微鏡觀察并拍照。Kisspeptins和GPR54陽性部位呈現(xiàn)棕色，其光密度值與Kisspeptins和GPR54的表達(dá)成正比。利用Imge ro Plus 6.0(IPP)圖像分析軟件處理數(shù)據(jù)，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，利用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

表1KISS-1、GPR54和β-actin基因引物序列

Table 1 Primer sequences ofKISS-1，GPR54 andβ-actin

基因Gene引物序列Primer sequences (5′→3′)產(chǎn)物長(zhǎng)度Product length/bpKISS-1GCCTTCAGGGAGACCTTGGAGAGCTCTCAGAGGAGCAGAG179GPR54β-actinACGGACTTAATGTTCCTGCTGTGACCGAGACCTGCTGGATGTAGTTCCTCCAGCCTTCCTTCCTGGGGCTTTAGTTTCGGTTTGTTGT119180

P

2 結(jié)果與分析

2.1 甘加藏羊發(fā)情周期下丘腦-垂體-卵巢軸組織中的KISS-1、GPR54基因表達(dá)

甘加藏羊發(fā)情周期下丘腦-垂體-卵巢軸組織中均有KISS-1和GPR54基因的表達(dá)。下丘腦中KISS-1的表達(dá)量在發(fā)情前期達(dá)到峰值，顯著(P<0.05)高于其他發(fā)情時(shí)期；GPR54的表達(dá)量在發(fā)情期顯著(P<0.05)高于發(fā)情前期、發(fā)情后期和間情期(圖1-A)。垂體中，發(fā)情前期KISS-1的表達(dá)量最高，發(fā)情后期顯著(P<0.05)低于其他各時(shí)期；GPR54的表達(dá)量在發(fā)情前期達(dá)到最高，顯著(P<0.05)高于其他各發(fā)情時(shí)期，發(fā)情后期表達(dá)量最低(圖1-B)。卵巢軸組織中KISS-1在間情期的表達(dá)量顯著(P<0.05)高于其他時(shí)期；GPR54在發(fā)情后期顯著(P<0.05)高于其他發(fā)情時(shí)期(圖1-C)。

A，下丘腦；B，垂體；C，卵巢軸。E，發(fā)情期；ME，發(fā)情后期；DE，間情期；PE，發(fā)情前期。不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。A， Hypothalamic; B， Pituitary; C， Ovary axis. E， Estrus; ME， Metaestrus; DE， Diestrus: PE， Proestrus. The bars with different lowercase letters indicated significant difference (P<0.05). The same as below.圖1 甘加藏羊發(fā)情周期各時(shí)期KISS-1、GPR54在HPOA中的相對(duì)表達(dá)量Fig.1 Relative expression of KISS-1 and GPR54 in HPO at different stages of estrus cycle in Ganjia Tibetan sheep

2.2 下丘腦-垂體-卵巢軸組織Kisspeptin和GPR54免疫組織化學(xué)染色

甘加藏羊發(fā)情周期各時(shí)期下丘腦、垂體和卵巢軸中均有Kisspeptin(圖2)和GPR54(圖3)蛋白表達(dá)，且陽性著色強(qiáng)弱差異明顯。下丘腦中，Kisspeptin陽性著色主要在錐體細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞的胞質(zhì)和顆粒細(xì)胞的胞核中(圖2-A～D)，在發(fā)情前期呈強(qiáng)陽性表達(dá)呈深棕色(圖2-D)，表達(dá)量高于其他時(shí)期(圖4-A)，GPR54主要在下丘腦神經(jīng)細(xì)胞的胞質(zhì)和軸突上表達(dá)(圖3-A～D)，發(fā)情期表達(dá)量明顯高于其他時(shí)期；在腺垂體中，Kisspeptin(圖2-E～H)和GPR54(圖3-E～H)最主要表達(dá)在嗜堿性細(xì)胞的胞質(zhì)中，嫌色細(xì)胞的胞質(zhì)中也有少量表達(dá)，二者均在發(fā)情前期表達(dá)量高于其他時(shí)期(圖4-B)；卵巢軸中的Kisspeptin(圖2-L)和GPR54(圖3-L)在發(fā)情前期主要表達(dá)于卵泡細(xì)胞，卵泡膜上有少量表達(dá)，發(fā)情期則主要在顆粒層和卵泡膜內(nèi)層為高表達(dá)(圖2-I、圖3-I)，進(jìn)入發(fā)情后期和間情期，主要在顆粒層、卵泡內(nèi)膜和卵泡外膜上表達(dá)，尤其在卵泡外膜的表達(dá)量增加(圖2-G、圖3-G)，發(fā)情期Kisspeptin蛋白表達(dá)量高于其他時(shí)期，發(fā)情前期GPR54蛋白表達(dá)量高于其他時(shí)期(圖4-C)。

3 討論

本研究探討了KISS-1和GPR54在甘加藏羊發(fā)情周期下丘腦-垂體-卵巢軸中的分布與表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，KISS-1 mRNA表達(dá)量在下丘腦組織中發(fā)情前期最高，而王軍等[16]在小尾寒羊下丘腦中發(fā)現(xiàn)其在發(fā)情期最高，與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果有出入，這可能是物種及生活環(huán)境差異所致。曹婷等[17]對(duì)五指山豬的研究發(fā)現(xiàn)，Kisspeptin表達(dá)量的不同會(huì)直接影響初情期出現(xiàn)的時(shí)間。甘加藏羊發(fā)情前期KISS-1表達(dá)量達(dá)到最高，是為發(fā)情期出現(xiàn)做充足準(zhǔn)備；GPR54的表達(dá)量在發(fā)情期到達(dá)峰值，而后逐漸降低，說明該系統(tǒng)主要在發(fā)情期調(diào)控甘加藏羊的生殖活動(dòng)，這與王軍等[16]對(duì)小尾寒羊的研究結(jié)果基本一致。Smith等[18]用Kisspeptin刺激離體培養(yǎng)的垂體細(xì)胞，能有效促進(jìn)FSH和LH的釋放，但是效果不及GnRH的作用明顯。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，垂體中KISS-1、GPR54在發(fā)情前期表達(dá)量高于其他發(fā)情時(shí)期，結(jié)合前人研究結(jié)果推測(cè)Kisspeptin在甘加藏羊垂體中可能主要是通過旁分泌或者自分泌的形式對(duì)FSH和LH的分泌起重要調(diào)控作用，說明甘加藏羊垂體組織中KISS-1/GPR54系統(tǒng)主要在發(fā)情前期調(diào)控生殖活動(dòng)。大量研究表明，Kisspeptin對(duì)卵巢中卵泡的形成和排卵過程具有十分重要的調(diào)控作用[19-20]。對(duì)大鼠[21]和綿羊[22]的研究發(fā)現(xiàn)，不同發(fā)情時(shí)期卵巢中KISS-1表達(dá)量不同，在排卵前顯著上升。Gottsch等[23]研究發(fā)現(xiàn)，在下丘腦的ARC區(qū)，雌二醇(E2)通過非經(jīng)典信號(hào)途徑抑制Kisspeptin的表達(dá)，從而負(fù)反饋調(diào)控GnRH的釋放。本研究發(fā)現(xiàn)卵巢軸組織中KISS-1的表達(dá)量在發(fā)情前期和發(fā)情期皆表現(xiàn)為低水平表達(dá)，而在間情期表達(dá)量最高，說明KISS-1的表達(dá)量在甘加藏羊發(fā)情期間受到催乳素和雌二醇等內(nèi)分泌激素的負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，對(duì)卵泡發(fā)育過程所發(fā)揮直接調(diào)控作用較弱，而主要通過KISS-1/GPR54系統(tǒng)耦聯(lián)下丘腦-垂體-卵巢軸來實(shí)現(xiàn)；此研究結(jié)果與呂甲強(qiáng)[24]在黑線雌性倉鼠卵巢中研究發(fā)現(xiàn)GPR54表達(dá)變化與KISS-1表達(dá)基本相近具有相似性，說明KISS-1/GPR54系統(tǒng)對(duì)甘加藏羊卵泡發(fā)育、成熟和排卵有著重要的調(diào)控作用，但同時(shí)也可能受到雌二醇等內(nèi)分泌激素的負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，另外該系統(tǒng)可能還參與妊娠活動(dòng)的調(diào)控作用，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

NC，神經(jīng)細(xì)胞；Nu，核仁；GC，顆粒細(xì)胞；PC，錐體細(xì)胞；AC，嗜酸性細(xì)胞；BC，嗜堿性細(xì)胞；CC，嫌色細(xì)胞；SC，竇狀毛細(xì)血管；CF，膠原纖維；PO，初級(jí)卵母細(xì)胞；FA，卵泡腔；FC，卵泡細(xì)胞；ZP，透明帶；SG，顆粒層；TF，卵泡膜；TFI，卵泡膜內(nèi)層；TFE，卵泡膜外層；IC，間質(zhì)細(xì)胞。下同。NC， Neurocyte; Nu， Nucleoli; GC， Granular cells; PC， Pyramidal cells; AC， Acidophilic cells; BC， Basophilic cells; CC， Chromophobe cells; SC， Sinusoidal capillaries; CF， Collagenous fibers; PO， Primary oocytes; FA， Follicular antrum; FC， Follicular cells; ZP， Zona pellucida; SG， Stratum granulosum; TF， Theca folliculi; TFI， Theca folliculi interna; TFE， Theca folliculi externa; IC， Interstitial cells. The same as below.圖2 甘加藏羊發(fā)情周期Kisspeptin在HPOA組織中的分布和表達(dá)Fig.2 Distribution and expression of Kisspeptin in HPOA tissue during estrus cycle of Ganjia Tibetan sheep by immunohistochemical staining

圖3 甘加藏羊發(fā)情周期GPR54在HPOA組織中的分布和表達(dá)Fig.3 Distribution and expression of GPR54 in HPOA tissue during estrus cycle of Ganjia Tibetan sheep by immunohistochemical staining

圖4 甘加藏羊發(fā)情周期HPOA組織Kisspeptin、GPR54陽性染色產(chǎn)物的平均積分光密度值Fig.4 Average integral optical density (IOD) of Kisspeptin and GPR54 positive staining in HPOA tissues during estrus cycle of Ganjia Tibetan sheep

人的大腦組織中，Kisspeptin表達(dá)量最高在弓狀核(ARC)和腦室前腹側(cè)區(qū)(AVPV)[25]，而Gottsch等[23]在小鼠上發(fā)現(xiàn)除了在ARC和AVPV區(qū)外，在下丘腦室周核(PeN)也有Kisspeptin的表達(dá)。Navarrov等[26]研究發(fā)現(xiàn)，大鼠GPR54的表達(dá)主要在GnRH的神經(jīng)核團(tuán)上。本實(shí)驗(yàn)對(duì)甘加藏羊研究發(fā)現(xiàn)，其下丘腦中Kisspeptin和GPR54分別在發(fā)情前期和發(fā)情期為強(qiáng)陽性表達(dá)，陽性產(chǎn)物主要表達(dá)在神經(jīng)細(xì)胞及錐體細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，而在顆粒細(xì)胞的胞核中發(fā)現(xiàn)陽性反應(yīng)。劉海斌等[27]利用免疫組織化學(xué)方法研究雞腦中Kisspeptin和GPR54的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，發(fā)情期腺垂體中有大量的Kisspeptin和GPR54分布，與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果相似，主要在嗜堿性細(xì)胞的胞質(zhì)中表達(dá)，在嫌色細(xì)胞胞質(zhì)中也有表達(dá)。卵巢軸中研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在發(fā)情前期，Kisspeptin和GPR54主要分布在卵泡細(xì)胞，卵泡膜細(xì)胞中呈弱陽性表達(dá)，發(fā)情期則主要在卵泡顆粒細(xì)胞及卵泡膜上表達(dá)，發(fā)情后期及間情期卵泡膜上的陽性表達(dá)減弱，主要在卵泡顆粒細(xì)胞及黃體細(xì)胞中表達(dá)，這一結(jié)果與Castellano等[21]對(duì)大鼠的研究結(jié)果一致。

綜上，KISS-1/GPR54系統(tǒng)對(duì)甘加藏羊發(fā)情周期起到一定的調(diào)控作用，下丘腦中通過與GnRH神經(jīng)元的直接接觸，促使GnRH釋放；垂體及卵巢軸中主要通過偶聯(lián)下丘腦-垂體-卵巢軸間接刺激調(diào)節(jié)方式對(duì)甘加藏羊的生殖生理活動(dòng)進(jìn)行調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，該系統(tǒng)對(duì)甘加藏羊發(fā)情周期及生殖活動(dòng)的調(diào)節(jié)作用主要在發(fā)情前期及發(fā)情期期間，尤其對(duì)GnRH的釋放及卵泡發(fā)育和成熟釋放過程有重要的調(diào)節(jié)作用，具體機(jī)制還有待研究。