何學(xué)友，蔡守平，鄭 宏，曾麗瓊，陳文玉，林曦碧，詹祖仁

(1.福建省林業(yè)科學(xué)研究院、國(guó)家林業(yè)局南方山地用材林培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350012；2.龍巖市新羅區(qū)森林病蟲(chóng)害防治檢疫站，福建 龍巖 364000； 3.泉州森林公園管理處，福建 泉州 362000； 4.明溪縣森林病蟲(chóng)害防治檢疫站，福建 明溪 365200；5.尤溪縣森林病蟲(chóng)害防治檢疫站，福建 尤溪 365100)

羅漢松(Podocarpusmacrophyllus)和竹柏(Podocarpusnagi)是我國(guó)園林綠化、庭園景觀的重要樹(shù)種，尤其是羅漢松經(jīng)濟(jì)價(jià)值大，種植數(shù)量多，我國(guó)每年均要從境外大量引種。橙帶藍(lán)尺蛾(MilioniabasalisWalker)屬鱗翅目(Lepidoptera)尺蛾科(Geometridae)藍(lán)尺蛾屬 (MilioniaWalker)，是近年來(lái)在我國(guó)南方地區(qū)羅漢松和竹柏上發(fā)生的一種重要食葉害蟲(chóng)[1-2]，發(fā)生嚴(yán)重時(shí)，將寄主植物的葉片取食殆盡，只剩光禿的枝干，我國(guó)廣西、廣東、海南、臺(tái)灣等地區(qū)以及國(guó)外的日本有發(fā)生和危害報(bào)道[3]。近年來(lái)，福建省各地也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)該蟲(chóng)的危害，尤其在漳州、龍巖、泉州、三明、福州等地苗圃的羅漢松、竹柏發(fā)生十分嚴(yán)重，株蟲(chóng)口密度高達(dá)數(shù)百頭，甚至上千頭，造成較大損失。王緝健等[2]首次報(bào)道了該蟲(chóng)在廣西危害竹柏的生物學(xué)特性，林偉等[1]報(bào)道了該蟲(chóng)在廣東的發(fā)生，記述了該蟲(chóng)的形態(tài)學(xué)并提出防控建議，橙帶藍(lán)尺蛾存在明顯的擴(kuò)散蔓延風(fēng)險(xiǎn)。目前，該蟲(chóng)的防治多以暴發(fā)時(shí)噴施化學(xué)農(nóng)藥為主，尚未見(jiàn)其生物防治的報(bào)道。因此，探尋該蟲(chóng)的有效防治方法，尤其是生物防治顯得十分必要。本文在比較不同金龜子綠僵菌菌株的菌落生長(zhǎng)速度、產(chǎn)孢量的基礎(chǔ)上，測(cè)定其對(duì)橙帶藍(lán)尺蛾幼蟲(chóng)的致病力，旨在篩選出優(yōu)良菌株，為橙帶藍(lán)尺蛾的防治提供生物防治資源。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

致病力測(cè)定使用的菌株為金龜子綠僵菌(Metarhiziumanisopliae)(以下簡(jiǎn)稱(chēng)綠僵菌)，菌株具體信息見(jiàn)表1。將各菌株斜面上孢子轉(zhuǎn)接到PDA平板培養(yǎng)基上，置于(25±1) ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10～15 d，充分產(chǎn)孢后收集孢子用于接種試驗(yàn)。

表1 供試金龜子綠僵菌菌株寄主與地理來(lái)源

1.2 菌株菌落生長(zhǎng)速度及產(chǎn)孢量

菌株菌落生長(zhǎng)速度和產(chǎn)孢量測(cè)定參考蔡守平[4]方法，每5 d采用十字交叉法測(cè)定1次菌落直徑，產(chǎn)孢量測(cè)定采用打孔器取菌碟法。每個(gè)菌株做3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)產(chǎn)孢量測(cè)定時(shí)均取3個(gè)菌碟，計(jì)數(shù)方法采用血球計(jì)數(shù)板法。

1.3 綠僵菌對(duì)橙帶藍(lán)尺蛾幼蟲(chóng)的致病力

1.3.1 試蟲(chóng)飼養(yǎng) 試蟲(chóng)為橙帶藍(lán)尺蛾幼蟲(chóng)，2019年5月12日采集于尤溪縣羅漢松苗圃，該苗圃羅漢松被橙帶藍(lán)尺蛾嚴(yán)重危害。幼蟲(chóng)采集后即帶回實(shí)驗(yàn)室，置于養(yǎng)蟲(chóng)籠中，以新鮮羅漢松葉飼養(yǎng)。1 d后挑選活動(dòng)正常、3～4齡的幼蟲(chóng)放置于昆蟲(chóng)飼養(yǎng)盒中，每飼養(yǎng)盒放置15頭，用于致病力測(cè)定。

1.3.2 致病力測(cè)定 致病力測(cè)定參考何學(xué)友等[5]方法，將各綠僵菌菌株的孢子使用0.03%的吐溫-80溶液配制成孢子懸浮液，含量為107孢子·mL-1，使用噴霧法接種，即將配制好的孢懸液均勻噴在幼蟲(chóng)體表，對(duì)照用無(wú)菌水進(jìn)行噴霧。每個(gè)菌株接種15頭幼蟲(chóng)為1個(gè)重復(fù)，設(shè)置4個(gè)重復(fù)，即每菌株共接種60頭試蟲(chóng)。處理完畢待蟲(chóng)體稍干后，以新鮮羅漢松枝葉進(jìn)行飼養(yǎng)。接種后每天觀察試蟲(chóng)的死亡情況，每2 d更換1次飼養(yǎng)枝葉，以輕觸試蟲(chóng)蟲(chóng)體無(wú)任何反應(yīng)為死亡標(biāo)準(zhǔn)，死亡后的試蟲(chóng)及時(shí)移出養(yǎng)蟲(chóng)盒，置于滅過(guò)菌的培養(yǎng)皿進(jìn)行保濕培養(yǎng)，觀察蟲(chóng)體是否有菌絲長(zhǎng)出及產(chǎn)孢，確定是否被綠僵菌感染。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析使用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)軟件處理，根據(jù)觀察結(jié)果統(tǒng)計(jì)接種后15 d的幼蟲(chóng)死亡率和感染率。采用DPS自帶的死亡率—時(shí)間機(jī)率值分析模塊計(jì)算不同綠僵菌對(duì)橙帶藍(lán)尺蛾幼蟲(chóng)的致病力，即以時(shí)間(d)的對(duì)數(shù)值為x，將死亡率轉(zhuǎn)換為機(jī)率值，并以機(jī)率值為y，模擬出致病力回歸方程，計(jì)算致死中時(shí)(LT50)，各菌株之間的LT50差異采用比例測(cè)定方法來(lái)檢驗(yàn)[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同綠僵菌菌株的菌落生長(zhǎng)速度及產(chǎn)孢量

不同來(lái)源的綠僵菌菌株菌落生長(zhǎng)速度和產(chǎn)孢量間存在顯著的差異(表2)。菌落生長(zhǎng)速度與產(chǎn)孢量之間并沒(méi)有顯著的相關(guān)性，主要是由菌株自身特性決定。如MaFZ-16菌株，雖然菌落生長(zhǎng)速度較快，15 d菌落直徑可達(dá)5.9 cm，但菌落以菌絲生長(zhǎng)為主，產(chǎn)孢量最低，僅0.76×108孢子·cm-2；而MaXJ-04菌株15 d菌落直徑為6.1 cm，但產(chǎn)孢量高達(dá)1.17×108孢子·cm-2。菌落生長(zhǎng)速度最快的為MaZPTR-01菌株，培養(yǎng)15 d的菌落直徑達(dá)6.5 cm；其次為MaFZ-13菌株，為6.2 cm。從產(chǎn)孢量看，最高的是MaFZ-13菌株，MaZPTR-01菌株次之，分別為1.33×108孢子·cm-2、1.28×108孢子·cm-2(兩者差異不顯著)，第三為MaXJ-04菌株。

表2 不同綠僵菌菌株的菌落生長(zhǎng)速度及產(chǎn)孢量

*：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；同列中不同小寫(xiě)字母為差異顯著(P<0.05)；下同。

2.2 綠僵菌對(duì)橙帶藍(lán)尺蛾幼蟲(chóng)的致死情況

幼蟲(chóng)接種孢子懸浮液后1～2 d，大部分幼蟲(chóng)未表現(xiàn)出感病癥狀；2～3 d后，部分幼蟲(chóng)出現(xiàn)不活躍、取食減少的情況，少量幼蟲(chóng)開(kāi)始死亡。接種MaFZ-13和MaXJ-04菌株的幼蟲(chóng)死亡速度較快，3～7 d出現(xiàn)死亡高峰，60%以上的幼蟲(chóng)在這個(gè)時(shí)段死亡，5～10 d為死亡高峰。此后也有部分幼蟲(chóng)逐漸死亡，但死亡速度明顯放緩。部分幼蟲(chóng)死亡后蟲(chóng)體逐漸變僵硬，不發(fā)臭，保濕培養(yǎng)1～2 d后有白色菌絲長(zhǎng)出體表，逐漸長(zhǎng)滿(mǎn)全身，隨后出現(xiàn)墨綠或深綠色孢子，后期整個(gè)蟲(chóng)體均布滿(mǎn)粉末狀的分生孢子，從死亡到完全產(chǎn)孢大約需要7 d(圖1)，但也有部分幼蟲(chóng)死亡后發(fā)臭腐爛。

圖1 橙帶藍(lán)尺蛾幼蟲(chóng)及其被綠僵菌感染狀

橙帶藍(lán)尺蛾幼蟲(chóng)接種不同綠僵菌菌株后死亡情況見(jiàn)圖2，幼蟲(chóng)死亡率隨時(shí)間的增加而逐漸提高，但不同菌株對(duì)幼蟲(chóng)的致死速度間存在顯著差異。接種MaFZ-13和MaXJ-04菌株幼蟲(chóng)死亡率較高，這2個(gè)菌株接種9 d后，幼蟲(chóng)死亡率達(dá)到或超過(guò)80%，而其它菌株則低于70%。接種15 d后，MaFZ-13和MaXJ-04菌株對(duì)幼蟲(chóng)的致死率分別達(dá)到96.7%和95.0%，其它菌株均低于90%，最低的是MaQL-02菌株，為71.7%。試驗(yàn)記錄期為15 d，此階段未死亡的幼蟲(chóng)，后續(xù)也逐漸死亡，但耗時(shí)較長(zhǎng)，只有接種MaQL-02和MaFZ-16菌株的出現(xiàn)了少數(shù)化蛹的情況，其他處理組均沒(méi)有幼蟲(chóng)化蛹。對(duì)照組幼蟲(chóng)死亡率為10%，未死亡的幼蟲(chóng)正常化蛹。

圖2 橙帶藍(lán)尺蛾幼蟲(chóng)接種不同綠僵菌菌株后的累計(jì)死亡率

2.3 不同綠僵菌菌株對(duì)橙帶藍(lán)尺蛾幼蟲(chóng)的致病力

不同綠僵菌菌株對(duì)橙帶藍(lán)尺蛾幼蟲(chóng)的致病力分析結(jié)果見(jiàn)表3。通過(guò)死亡機(jī)率值—時(shí)間模型進(jìn)行不同菌株的致病力回歸方程模擬，經(jīng)檢驗(yàn)，各方程擬合程度均達(dá)到顯著水平，表明時(shí)間與累計(jì)死亡率顯著相關(guān)，但不同菌株對(duì)橙帶藍(lán)尺蛾幼蟲(chóng)的致病力存在顯著差異。從校正死亡率和僵蟲(chóng)率方面來(lái)看，接種MaFZ-13和MaXJ-04菌株的較高，15 d幼蟲(chóng)校正死亡率分別達(dá)到96.3%和94.4%，僵蟲(chóng)率分別為75%和71.7%；而接種其它菌株的校正死亡率低于90%，最低的是MaQL-02菌株，僅為68.5%，僵蟲(chóng)率僅為41.7%。同時(shí)，從不同菌株的致死中時(shí)(LT50)來(lái)看，MaFZ-13菌株最短，MaXJ-04菌株次之，分別為5.01 d和5.48 d，顯著短于其它菌株。

表3 不同綠僵菌菌株對(duì)橙帶藍(lán)尺蛾幼蟲(chóng)的致病力

3 結(jié)論與討論

橙帶藍(lán)尺蛾目前多以化學(xué)藥劑進(jìn)行應(yīng)急防治為主，探尋該蟲(chóng)的生物防治資源尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)測(cè)定比較了5株來(lái)源不同的綠僵菌菌株對(duì)橙帶藍(lán)尺蛾幼蟲(chóng)的致病力，篩選出對(duì)橙帶藍(lán)尺蛾幼蟲(chóng)致死率高、致死速度快和感染率好的MaFZ-13和MaXJ-04菌株，且這2個(gè)菌株生長(zhǎng)速度快，產(chǎn)孢量高，可作為該蟲(chóng)優(yōu)良的生物防治資源加以利用，林間相關(guān)應(yīng)用技術(shù)有待進(jìn)一步深入研究。

綠僵菌、白僵菌等蟲(chóng)生真菌致病機(jī)理一般是通過(guò)體表侵入害蟲(chóng)體內(nèi)，并在害蟲(chóng)體內(nèi)不斷增殖，通過(guò)消耗營(yíng)養(yǎng)、機(jī)械穿透、產(chǎn)生毒素等作用使害蟲(chóng)致死，通常致死害蟲(chóng)過(guò)程需要3～6 d。本研究中橙帶藍(lán)尺蛾幼蟲(chóng)接種致病力高的綠僵菌菌株后死亡高峰出現(xiàn)在3～7 d，符合綠僵菌的致病過(guò)程[7-8]。但在防治實(shí)踐中，綠僵菌的防治效果還受到林間環(huán)境、寄主免疫抵御等多種因素影響，導(dǎo)致應(yīng)用時(shí)防效往往較慢，甚至需要10 d以上，相對(duì)化學(xué)農(nóng)藥來(lái)說(shuō)，較慢的致死效應(yīng)會(huì)使綠僵菌在橙帶藍(lán)尺蛾這種爆發(fā)性的害蟲(chóng)防治中受到一定限制。為了解決防治時(shí)效慢的問(wèn)題，很多學(xué)者嘗試將真菌殺蟲(chóng)劑與低劑量農(nóng)藥復(fù)配，以達(dá)到協(xié)同增效的作用[9]，提高防治效果，如低劑量印楝素與殺蝗綠僵菌混用比單獨(dú)施用綠僵菌相對(duì)亞洲小車(chē)蝗的LT50縮短了3.17 d[10]；綠僵菌與亞致死劑量敵殺死混用對(duì)馬尾松毛蟲(chóng)的LT50可提前7 d[11]；綠僵菌與亞致死劑量的殺蟲(chóng)單混合使用后，對(duì)椰心葉甲的致死率顯著提高，LT50縮短了2.1 d[12]。其機(jī)理是農(nóng)藥通過(guò)作用于昆蟲(chóng)的外骨骼，使真菌更容易侵入害蟲(chóng)蟲(chóng)體，這樣既可以達(dá)到快速致死的目的又可以提高真菌的感染率，并可大幅減少農(nóng)藥使用量，減少農(nóng)藥對(duì)生態(tài)環(huán)境破壞，對(duì)避免害蟲(chóng)產(chǎn)生抗性方面有積極的作用[13-14]。因此，在應(yīng)用綠僵菌生物防治橙帶藍(lán)尺蛾過(guò)程中，采用菌藥復(fù)配策略值得今后深入開(kāi)展研究。