胡亞楠，陳奶蓮，張 輝，馬祥慶，吳鵬飛，鄒顯花

(福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院， 福建 福州 350002)

磷是植物生長不可缺少的重要元素，是植物體內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)等主要有機(jī)大分子的必須構(gòu)成成分，在光合作用、呼吸作用以及酶的調(diào)節(jié)過程中起重要作用[1]。我國南方以酸性土壤為主，土壤中全磷含量很高，但磷元素在酸性土壤中易被鐵鋁氧化物或氫氧化物固定，土壤有效磷含量降低，使得林木可吸收利用的土壤有效磷極度匱乏，導(dǎo)致植物“遺傳學(xué)缺磷”現(xiàn)象嚴(yán)重[2]。研究表明，植物在長期的低磷適應(yīng)過程中，為了最大限度地挖掘土壤中的有限磷資源形成特有的響應(yīng)機(jī)制，可通過根系生理生化的變化調(diào)整，如分泌有機(jī)酸、氨、酶、H+等物質(zhì)與生長環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)交流，對(duì)生長微區(qū)進(jìn)行改造[3-4]，使根際土壤酸化、提高根際微生物活性等，加快植物對(duì)土壤有效磷的吸收和利用。植物根系分泌的H+具有調(diào)節(jié)根際土壤pH值、氧化還原電位等作用，影響根際營養(yǎng)元素的有效性[5]。國內(nèi)外學(xué)者對(duì)大豆[Glycinemax(Linn.) Merr.][6]、 小麥(TriticumaestivumL.)[7]、 玉米(ZeamaysLinn.)[8]等農(nóng)作植物也進(jìn)行了大量的研究，表明植物根系的H+分泌會(huì)加速難溶性無機(jī)磷的分解和利用?？梢姡岣咧参镒陨砦绽猛寥懒椎哪芰Τ蔀榻鉀Q磷缺乏問題的重要途徑。

杉木[Cunninghamialanceolata(Lamb.) Hook.]是我國南方重要的造林樹種之一，在人工林中占有重要地位。土壤有效態(tài)磷匱乏是導(dǎo)致南方杉木人工林地力衰退的重要原因之一，已嚴(yán)重影響了杉木人工林的持續(xù)經(jīng)營[9]。傳統(tǒng)生產(chǎn)中施用大量磷肥，增加生產(chǎn)成本的同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致磷礦資源浪費(fèi)、土壤退化和水體污染[10]，因此，充分發(fā)掘植物自身潛力來適應(yīng)土壤有效磷的匱乏是新的研究趨勢。研究發(fā)現(xiàn)，在缺磷條件下通過分泌H+，增加根際酸化能力，促進(jìn)環(huán)境中難溶性磷的利用這一抗逆性策略在杉木中已得到了印證[11]。然而，傳統(tǒng)研究方法中的瓊脂指示法、電極法、酸堿中和滴定法等均是通過pH值的變化間接換算來推論H+的分泌情況，難以準(zhǔn)確定量研究離子流的動(dòng)態(tài)變化，因此無法深入揭示杉木應(yīng)對(duì)低磷脅迫的內(nèi)在機(jī)制?？梢姡绾螒?yīng)用精確測定根系pH值變化的方法來進(jìn)行高效利用磷杉木根系分泌H+與提高土壤磷利用效率方面的研究顯得極為迫切。近年來，非損傷微測技術(shù)(non-damage micromeasurement technique， NMT)在林業(yè)上的應(yīng)用為該研究提供了技術(shù)支持，該技術(shù)利用特異性離子/分子選擇電極，能夠在不傷害活體樣品的情況下，實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)地獲取進(jìn)出樣品離子的流速等信息，能夠準(zhǔn)確測量植物組織和細(xì)胞離子平衡調(diào)控的信息[12]。鑒于此，本研究選擇M28與M32兩個(gè)不同磷利用效率杉木家系幼苗作為供試材料，通過設(shè)置正常供磷(high phosphorus supply， H-P)、中度缺磷(low phosphorus supply， L-P)與重度缺磷(no phosphorus supply， N-P)3種不同的磷濃度肋迫及3、8、15 d三個(gè)不同時(shí)間梯度的處理，利用NMT分析不同家系杉木在不同處理?xiàng)l件下完整根系及不同部位的H+流動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，比較不同磷利用效率杉木根系在低磷脅迫下H+分泌差異，研究其適應(yīng)低磷脅迫的H+流機(jī)制，為杉木林區(qū)土壤磷素的充分利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

選擇福建省漳平五一國有林場杉木無性系種子園M28、M32單系采種培育的長勢均一、根系完整、無病害的半胞家系幼苗為試驗(yàn)材料，其平均地徑為1.6 mm，平均苗高為9.5 cm。供試幼苗在溫室內(nèi)培育5個(gè)月，平均室溫20.3 ℃，相對(duì)濕度78%。

1.2 研究方法

供試幼苗預(yù)先進(jìn)行室內(nèi)水培模擬試驗(yàn)，在水培環(huán)境中緩苗15 d，緩苗后選取生長狀況相近的幼株，用去離子水仔細(xì)清洗，去除根系殘留物質(zhì)。將處理好的幼株移入裝有2 L營養(yǎng)液的塑料桶中，每盆移入兩株杉木幼苗，設(shè)置3種不同的磷濃度處理[H-P(31 mg·L-1)、L-P(16 mg·L-1)、N-P(0 mg·L-1)]和3個(gè)處理時(shí)間梯度(3、 8、 15 d)，每處理 4盆，每盆兩株，然后在每株苗上選取兩條根進(jìn)行測試。以KH2PO4作為磷源供應(yīng)的營養(yǎng)液濃度：H-P(1.0 mmol·L-1KH2PO4)、L-P(0.5 mmol·L-1KH2PO4)、N-P(0 mmol·L-1KH2PO4)，其中，L-P與N-P處理的鉀濃度用KCl 補(bǔ)齊至正常供磷相同的水平，以消除處理間鉀水平的差異。其它營養(yǎng)元素采用吳鵬飛[2]改良的1/2 Hoagland營養(yǎng)液配方，即5.0 mmol·L-1KNO3、2.0 mmol·L-1MgSO4·7H2O、5.0 mmol·L-1Ca(NO3)2·4H2O、1 mL·L-1Fe-EDTA、Arnon 微量元素(46.3 μmol·L-1H3BO3、0.3 μmol·L-1CuSO4·5H2O、0.8 μmol·L-1ZnSO4·7H2O、9.1 μmol·L-1MnCl2·4H2O、0.4 μmol ·L-1H2MO4·4H2O)，調(diào)節(jié)營養(yǎng)液pH值至5.0。每隔7 d換1次營養(yǎng)液，每隔4 h通氣20 min，以保證苗木供氧充足。在溫室大棚內(nèi)進(jìn)行供磷處理試驗(yàn)，試驗(yàn)期間大棚內(nèi)溫度27～30 ℃，相對(duì)濕度75%，每天平均光照14 h。

1.3 指標(biāo)測定

在不同濃度的磷脅迫下，分別在3、8、15 d用NMT法對(duì)不同供試幼苗根系進(jìn)行H+測試。為降低根系表面的附著離子對(duì)待測離子試驗(yàn)結(jié)果的影響，測定前根系用去離子水小心沖洗干凈，放入基本測試液(0.1 mmol·L-1KCl、 0.1 mmol·L-1CaCl2、 0.1 mmol·L-1MgCl2、 0.5 mmol·L-1NaCl、 0.3 mmol·L-1MES和 0.2 mmol·L-1Na2SO)平衡20 min。平衡后將供試幼苗放入10 mm培養(yǎng)皿底部，等待基本測試液完全浸過根系，用H+選擇性電極沿根系方向進(jìn)行測試。根系根尖到根端區(qū)域均分為根端、中上、中下、根尖4個(gè)部位，共計(jì)4個(gè)樣點(diǎn)。 每個(gè)樣點(diǎn)的數(shù)據(jù)采集直至離子流穩(wěn)定，完整根系離子流數(shù)據(jù)為每個(gè)測定區(qū)域內(nèi)數(shù)個(gè)測定位置離子流的平均值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析，Excel軟件進(jìn)行繪圖。離子流速根據(jù)旭月科技有限公司開發(fā)的Mageflux軟件進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同供磷處理對(duì)杉木完整根系H+流的影響

由圖1可見，M28、M32在不同供磷和不同時(shí)間處理下，完整根系對(duì)H+均表現(xiàn)為吸收，但2個(gè)杉木家系H+的凈內(nèi)流量存在差異。M32在不同供磷和不同時(shí)間處理下，H+流的變化均無顯著差異(P>0.05)。M28在L-P處理8 d下，根系H+的凈內(nèi)流量顯著高于H-P處理(P<0.05)，其他各處理間H+流的變化差異不顯著(P>0.05)；在相同時(shí)間不同供磷處理下，H+吸收量均為在L-P處理下最大。同一供磷處理下，M28在處理8 d時(shí)對(duì)H+的吸收量最大，且在不同供磷處理下，根系H+的內(nèi)流均符合先增強(qiáng)后減弱的趨勢，總體表現(xiàn)為8 d>15 d>3 d。

(a)M28 (b)M32

注：不同大寫字母表示同一處理時(shí)間不同處理水平的H+凈流量差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)；不同小寫字母表示同一處理水平不同處理時(shí)間的H+凈流量差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)。Note: different capital letters indicate that the difference of the H+net flow reaches a significant level (P<0.05) with different treatment levels at the same treatment time. Different lowercase letters indicate that the difference of the H+net flow reaches a significant level (P<0.05) with the same treatment level at different treatment times.

圖1 不同杉木家系完整根系H+流隨處理時(shí)間的變化
Figure 1 Comparison of H+flow changes of complete root systems of different Chinese fir families with time

2.2 不同供磷處理對(duì)杉木根系不同部位H+流的影響

由表1可見，根系的不同部位在不同供磷處理下，吸收及外排H+的能力各不相同。除處理3 d外，L-P和N-P處理8、15 d，M28、M32根系各部位對(duì)H+都表現(xiàn)為吸收，其中，根尖部位的吸收量顯著大于根系中下、中上及根端3個(gè)部位(P<0.05)，而其他3個(gè)部位的H+吸收量差異不顯著(P>0.05)。M28在處理8 d時(shí)的這一規(guī)律表現(xiàn)得尤為明顯，在L-P與N-P處理下的根尖H+吸收量分別達(dá)到最低值的6和5.5倍。低磷處理3 d，M28與M32均表現(xiàn)出不同程度的H+外排現(xiàn)象。其中，M28根系根端部位在L-P處理下出現(xiàn)H+外排現(xiàn)象，在N-P處理下，其根系中上、中下部位均有H+外排，但兩個(gè)部位的排放量無顯著差異(P>0.05)。M32僅表現(xiàn)為根系中上部在N-P處理時(shí)出現(xiàn)H+外排。在處理第8天，M28在L-P處理下根尖、中下與中上部位的H+的吸收量顯著大于其他處理的相同部位，M28、M32根系的同一部位在其他不同供磷處理下，總體上表現(xiàn)為差異不顯著。兩個(gè)家系杉木在不同處理時(shí)間和不同供磷處理下各部位對(duì)H+的吸收總體表現(xiàn)為根尖>中下>中上，根端的吸收量大于中上部。

表1 不同杉木家系根系不同部位的H+流變化比較 Table 1 Comparison of H+ flow changes at different root sites of different Chinese fir families

注： 同列數(shù)據(jù)后不同大寫字母表示同一處理根系不同部位的H+凈流量差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)；不同小寫字母表示根系同一部位在不同處理?xiàng)l件下的H+凈流量差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)；正值表示H+外排，負(fù)值表示H+吸收。Note: different capital letters indicate that the difference of the H+net flow reaches a significant level (P<0.05)at different sites of the same root system. Different lowercase letters indicate that the difference of the H+net flow reaches a significant level (P<0.05)at the same site of the root system with different treatment levels. Positive values represent the efflux of H+, and negative values represent the absorption of H+.

3 討論與結(jié)論

在植物生長的發(fā)育過程中，植物根系是吸收和代謝的重要器官，根系周圍土體微域更是植物與土壤進(jìn)行無聲交流的重要界面，根系一方面從生長介質(zhì)中吸收養(yǎng)分，另一方面也和生長介質(zhì)進(jìn)行大量不同的H+、離子交換等。研究表明，在逆境脅迫下植物根系H+流會(huì)發(fā)生改變[13-14]，影響根系生長微域，且不同植物或者同一植物的不同品系根系H+流對(duì)環(huán)境的適應(yīng)策略也不同，在磷脅迫下植物根系主要表現(xiàn)為H+外排，BERTRANDetal[15]認(rèn)為在石灰性土壤中，植物可以通過增強(qiáng)H+的釋放來響應(yīng)低磷脅迫。NEUMANNetal[16]等發(fā)現(xiàn)缺磷顯著增加了番茄(LycopersiconesculentumMill.)、鷹嘴豆(Cicerarietinum)和白羽扇豆(Lupinusalbus)根的H+凈釋放。張振海等[6]發(fā)現(xiàn)低磷脅迫導(dǎo)致不同基因型大豆的根系均能主動(dòng)向外界釋放H+。但本研究發(fā)現(xiàn)M28、M32在不同供磷和不同時(shí)間處理下，完整根系對(duì)H+均表現(xiàn)為吸收。除處理3 d外，在L-P、N-P處理8 d與15 d，M28、M32根系各部位對(duì)H+都表現(xiàn)為吸收。

研究表明，根系分泌物H+外排是一種應(yīng)激反應(yīng)，例如李佳等[17]研究了擬南芥[Arabidopsisthaliana(L.) Heynh.]在感知外界環(huán)境變化時(shí)，根系H+的外排和內(nèi)流會(huì)發(fā)生變化，在水分脅迫處理4 h后，根系距離靜止中心0～150的H+由吸收變?yōu)橥馀?。此外，在磷缺乏誘導(dǎo)根際釋放H+的機(jī)制研究中，魏源等[18]檢測了AHA1、AHA2 和AHA7三種基因型擬南芥，發(fā)現(xiàn)在低磷脅迫4 h根系H+外排達(dá)到峰值，其后植物根系釋放H+量開始下降。在本研究中兩個(gè)杉木家系暴露于低磷條件下3 d時(shí)，M28、M32中上、中下及根端部位有少量的H+外流現(xiàn)象，M28在L-P處理下開始出現(xiàn)這種現(xiàn)象，M32在N-P處理下才發(fā)現(xiàn)H+外排?？梢?，M28對(duì)外界磷環(huán)境的感應(yīng)比M32更為敏感。這種現(xiàn)象隨著時(shí)間的推移發(fā)生了改變，在處理8 d、15 d，不同供磷處理均未觀測到H+的外排。據(jù)推測，植物的H+外排受到植物其他代謝策略抑制的影響，在短期應(yīng)激反應(yīng)后根系中H+外排逐漸減弱[17-18]。進(jìn)一步證實(shí)了在L-P和N-P處理下根系H+外排是一種應(yīng)激反應(yīng)，推測在L-P、N-P處理3 d內(nèi)，M28、M32根系處于H+釋放狀態(tài)，在短期應(yīng)激反應(yīng)后則表現(xiàn)出因代謝受逆境脅迫抑制植株生命代謝活動(dòng)而受到影響，H+流由外排轉(zhuǎn)變?yōu)槲铡?/p>

眾所周知，土壤中難溶性磷的存在是根系分泌H+來提高其應(yīng)對(duì)低磷脅迫的能力的先決條件，然而，大多數(shù)研究并未考慮到難溶性磷會(huì)被根系分泌的H+營造的酸化環(huán)境所溶解，這是低磷脅迫下植物的適應(yīng)性反應(yīng)。在根際沒有難溶性磷的情況下，根系分泌的H+不會(huì)對(duì)土壤有效磷產(chǎn)生影響。即在脅迫初期，植物還未啟動(dòng)相應(yīng)的響應(yīng)策略時(shí)，M28、M32都有H+應(yīng)激性外排以酸化環(huán)境，增加根際環(huán)境中有效磷含量，然而，M28、M32根系分泌H+沒有增加根系中磷的含量，因?yàn)榄h(huán)境中不存在難溶性磷。因此，推測在根系H+外排未達(dá)到預(yù)期效果時(shí)，根據(jù)植物成本-收益理論[19]，M28、M32可能通過其他策略以適應(yīng)低磷脅迫環(huán)境。研究表明，杉木可以通過增強(qiáng)葉片和根系酸性磷酸酶活性、加強(qiáng)保護(hù)酶活性、降低葉片光合固氮量、改變根部形態(tài)等途徑提高土壤磷的使用效率和促進(jìn)植物磷的利用，用以應(yīng)對(duì)低磷環(huán)境[20]。

研究表明，H+通量的來源和植物根部對(duì)陽離子和陰離子的差異攝取有關(guān)[24]。由于南方林地土壤缺乏有效磷，在長期的進(jìn)化過程中，一些植物對(duì)低磷環(huán)境產(chǎn)生多種適應(yīng)方式和適應(yīng)特征, 當(dāng)植物遭受低磷脅迫時(shí), 植物自身有一定的調(diào)節(jié)能力[25]。在本研究中，兩個(gè)杉木家系完整根系在L-P和N-P處理8、15 d時(shí)對(duì)H+的吸收大于H-P處理。有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)植物感受到缺磷信號(hào)時(shí)，儲(chǔ)存在液泡中的磷被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中，供給細(xì)胞生命活動(dòng)所需要的磷營養(yǎng)，同時(shí)維持胞質(zhì)中磷的平衡[26]。在這種策略下杉木在消耗磷酸根離子時(shí)，本身的補(bǔ)償機(jī)制迫使根系會(huì)從外界汲取更多的H+以平衡細(xì)胞質(zhì)酸堿環(huán)境。磷素在細(xì)胞中多以磷酸根負(fù)離子的形式存在，在感受到低磷脅迫后，磷酸根離子從液泡中跑出參與植物的生理代謝供植物正常生長發(fā)育，導(dǎo)致胞質(zhì)陰陽離子比例失調(diào)。有研究表明，無論陽離子-陰離子平衡和根細(xì)胞中的電荷-pH值調(diào)節(jié)所涉及的確切機(jī)制是什么，當(dāng)陰離子多于陽離子時(shí)，會(huì)有OH-釋放或者H+被吸收，通過有效的pH-stat系統(tǒng)將細(xì)胞質(zhì)pH值維持在約7.3的小范圍內(nèi)[24]。即植物細(xì)胞質(zhì)中磷酸根離子增加時(shí)，短暫的打破了根系中陰陽離子的平衡，隨之H+會(huì)被從外界吸收以補(bǔ)償進(jìn)入胞質(zhì)的過量負(fù)電荷，維持細(xì)胞離子平衡，故在L-P和N-P處理下杉木完整根系對(duì)H+的吸收大于H-P處理。

綜上所述，在酸性培養(yǎng)環(huán)境中，不同杉木家系會(huì)通過H+內(nèi)流來適應(yīng)低磷脅迫，且處理的第8、15天時(shí)L-P和N-P處理下杉木完整根系對(duì)H+的吸收大于H-P處理。結(jié)合根系不同部位H+的流向分析得出，M28與M32分別在L-P和N-P處理3 d時(shí)開始表現(xiàn)出少量H+外排現(xiàn)象，其中，M28根系H+流對(duì)低磷環(huán)境的響應(yīng)比M32更為敏感。隨著時(shí)間的推移，處理8、15 d后，均未在L-P和N-P處理下觀測到H+的外排，可見低磷條件下根系H+外排是一種應(yīng)激反應(yīng)。在這一研究結(jié)果基礎(chǔ)上，下一階段將針對(duì)低磷脅迫3 d內(nèi)杉木根系的H+外排與吸收情況進(jìn)行更為詳盡的研究，以進(jìn)一步揭示杉木根系H+流適應(yīng)低磷脅迫的內(nèi)在機(jī)制。