冉玉琴,陳 雨,彭 杰,董 鋒,楊國華,張 良,*

(1.西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,食品生物技術(shù)四川省高校重點實驗室,四川成都 610039; 2.四川品品食品有限公司,四川成都 611732; 3.四川省丹丹郫縣豆瓣集團股份有限公司國家企業(yè)技術(shù)中心,四川省豆瓣釀制工程實驗室,食品用酶生物發(fā)酵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心,四川成都 611732)

郫縣豆瓣是一種中國傳統(tǒng)地方特色發(fā)酵食品,主要是由二荊條辣椒、蠶豆、小麥粉和鹽等原料制成[1-2],以其味辣香醇、黏稠絨實、紅棕油亮、醬香濃郁等特點，在我國醬類產(chǎn)品中獨樹一幟,是川菜中重要的調(diào)味料,被譽為“川菜之魂”[3]。作為一種極具地方特色的發(fā)酵型調(diào)味品,其特殊的發(fā)酵工藝、原料及環(huán)境因素造就了郫縣豆瓣獨特的風(fēng)味品質(zhì)[4]。郫縣豆瓣的生產(chǎn)工藝包括前發(fā)酵和后發(fā)酵2個階段:前期發(fā)酵主要是指蠶豆霉瓣子的制曲和辣椒坯的預(yù)處理,制作周期分別為40 d和6個月左右。后熟發(fā)酵主要是將成熟霉瓣子和成熟辣椒坯按比例配料混合,加入適量食鹽和水,進(jìn)入發(fā)酵池發(fā)酵,經(jīng)過一定時期的翻曬和陳化,經(jīng)過郫縣豆瓣特有的翻、曬、露工藝成為深受歡迎的產(chǎn)品。紅豆瓣成熟其為6個月到1年左右,成熟一年以上為黑豆瓣[5]。

脂肪作為郫縣豆瓣不可或缺的部分,賦予其油亮的特性,增加人民群眾的消費意向。在發(fā)酵過程,大量微生物分泌的相關(guān)酶系將脂肪分解成脂肪酸和甘油[6]。有研究表明,攝入適當(dāng)比例的飽和、單不飽和、多不飽和脂肪酸可預(yù)防心腦血管疾病、癌癥、關(guān)節(jié)炎等[7];脂肪酸作為郫縣豆瓣一些風(fēng)味物質(zhì)的前體成分,更是醛類、醇類、呋喃類等的重要來源[8]。

郫縣豆瓣作為一種國家地理標(biāo)志產(chǎn)品,國外對于它的研究幾乎沒有。目前,國內(nèi)對于郫縣豆瓣的研究主要集中在香氣成分分析[9-10]、后發(fā)酵期真菌細(xì)菌的演替變化分析[11-12]和黃曲霉毒素的分析[13]以及有機酸[14]、氨基酸[15]的種類及含量的研究分析。針對郫縣豆瓣脂肪酸的報道較少,僅有部分涉及揮發(fā)性脂肪酸[16],但沒有對不同發(fā)酵時間點郫縣豆瓣的脂肪酸進(jìn)行定量及比對分析。因此,本課題通過追蹤8個不同后發(fā)酵時間的郫縣豆瓣,利用氣相色譜儀測定其脂肪酸的種類和含量,采用主成分分析法研究其組成差異,以期為郫縣豆瓣后發(fā)酵工藝改良提供科學(xué)依據(jù),也為進(jìn)一步挖掘地域特色發(fā)酵產(chǎn)品的科技內(nèi)涵提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

郫縣豆瓣 取自四川省丹丹郫縣豆瓣集團股份有限公司生產(chǎn)車間;石油醚(60～90 ℃)、硫酸、甲醇、正己烷 均為分析純,成都市科隆化學(xué)品有限公司;十一碳酸甘油三酯、37種脂肪酸甲酯 均為色譜純,斯坦福分析化學(xué)公司。

超低溫冰箱 美國Thermo Fisher Scientific公司;TNG-T98型真空干燥儀 太倉市華美生化儀器廠;JXFSTPRP-24型研磨儀 上海警信科技有限公司;Forma 900 series型全自動索氏抽提儀 賽默飛世爾科技(中國)有限公司;XW-80A型渦旋混合器 四川蜀科儀器有限公司;7820A型氣相色譜儀 美國安捷倫科技公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 采樣及預(yù)處理 分別選取后發(fā)酵1、3、6、9、12、18、24和36月(M)的郫縣豆瓣,取樣時選取上層(距表面0～20 cm)、中層(距表面30～50 cm)、下層(距池底0～20 cm)的郫縣豆瓣,混合均勻后密封,4 ℃低溫運至實驗室。經(jīng)冷凍干燥后,粉碎備用。

1.2.2 粗脂肪的提取 采用GB 5009.6-2016《索氏抽提法》[17],準(zhǔn)確稱取2.00 g樣品于索氏提取儀,加入60 mL石油醚;提取條件為:溫度75 ℃,經(jīng)浸泡20 min、淋洗60 min、回收溶劑10 min、蒸干5 min后取出,80 ℃烘干至恒重,計算粗脂肪含量。

式中:A0為豆瓣粉樣品質(zhì)量,mg;A1為浸提杯質(zhì)量,mg;A2為含有豆瓣油脂的浸提杯的質(zhì)量,mg。

1.2.3 脂肪酸分析 甲酯化反應(yīng)[18]:稱取0.01 g上述油脂于10 mL具塞試管中,加入1 mL 2.5 mol/L內(nèi)標(biāo)溶液(十一碳酸甘油三酯)與3 mL 2.5 mol/L 硫酸-甲醇溶液,70 ℃水浴加熱至油樣溶解。期間每10 min渦旋振蕩30 s,冷卻至室溫后加入1 mL正己烷多次振蕩萃取,合并上清液過0.2 μm微孔濾膜后待測。

1.2.4 色譜條件 氣相色譜儀配備FID 檢測器;ZB-FAME毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.2 μm);檢測器溫度280 ℃;升溫程序:50 ℃保持2 min,以8 ℃/min 升溫至180 ℃,保持5 min后,以5 ℃/min 升溫至230 ℃,保持5 min;載氣為氫氣,流速1.2 mL/min;燃?xì)鉃闅錃?流速30 mL/min;空氣流速300 mL/min,輔助氣體為氮氣,流速25 mL/min。根據(jù)混合標(biāo)準(zhǔn)品確定保留時間,以十一碳酸甘油三酯為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行分析處理。

式中:Xi為試樣中脂肪酸甲酯i含量(g/100 g);Fi為脂肪酸甲酯i的響應(yīng)因子;Ai為試樣中脂肪酸甲酯i的峰面積;AC11為試樣中加入的內(nèi)標(biāo)物十一碳酸甲酯峰面積;ρC11為十一碳酸甘油三酯濃度(mg/mL);VC11為試樣中加入十一碳酸甘油三酯體積(mL);1.0067為十一碳酸甘油三酯轉(zhuǎn)化成十一碳酸甲酯的轉(zhuǎn)換系數(shù);m為試樣的質(zhì)量(mg)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗設(shè)3次重復(fù),測定結(jié)果以平均值(誤差的形式表示。數(shù)據(jù)處理用SPSS 19.0軟件進(jìn)行方差分析(ANOVA)與主成分分析,通過Pearson相關(guān)系數(shù)分析脂肪酸之間的相關(guān)性,采用Origin 18.0繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同后發(fā)酵期郫縣豆瓣的粗脂肪含量

如圖1為不同后發(fā)酵期郫縣豆瓣粗脂肪含量,結(jié)果表明:粗脂肪在后發(fā)酵期間變化不大,含量為3.46%～4.29%(w/w),與豆醬(4.26%)[19]、醬油(6.15%)[20]等其他豆類發(fā)酵調(diào)味品含量差異不大。隨著后發(fā)酵進(jìn)行,粗脂肪含量呈現(xiàn)先下降后上升再下降的趨勢,究其原因,可能是前期微生物演替過程比較劇烈,消耗了大量的粗脂肪,但隨著代謝的減弱、酶系的作用以及郫縣豆瓣特有的“翻、曬、露”工藝,使得郫縣豆瓣中大量的可溶物溢出,導(dǎo)致了粗脂肪的含量變化。

圖1 不同后發(fā)酵時期郫縣豆瓣醬的粗脂肪含量Fig.1 Fat contents of Pixian soybean pasteduring different post-fermentation stages

有報道表明,假單孢菌[21]、葡萄球菌以及一些曲霉[22]都具有一定產(chǎn)脂肪酶的能力,這些微生物在郫縣豆瓣后發(fā)酵期也廣泛存在[12,23],這可能造成了郫縣豆瓣粗脂肪的減少。另外,脂肪酶屬于羧基水解酶類,能將天然底物油脂逐步地水解成甘油、脂肪酸和甘油單酯或二酯[24]。隨著后發(fā)酵進(jìn)行,可溶物的溶出、pH的降低[25]、溫度隨季節(jié)天氣的變化[26]等,都會影響微生物代謝脂肪酶的能力以及脂肪酶的活性。

2.2 不同后發(fā)酵期郫縣豆瓣的脂肪酸組成

圖2為6個月后發(fā)酵期郫縣豆瓣樣品的氣相色譜圖。表1為8個不同后發(fā)酵時期的郫縣豆瓣樣品中脂肪酸組成。由表1可知,不同后發(fā)酵期的郫縣豆瓣樣品共檢出9種脂肪酸,含量存在一定差異?？傊舅岢尸F(xiàn)先下降后上升再下降后上升的動態(tài)變化,這與韓國大醬持續(xù)升高存在差異[27]。這可能是由于制作韓國大醬和郫縣豆瓣醬的原輔料、發(fā)酵工藝以及微生物區(qū)系的不同所導(dǎo)致的。在24～36 M,脂肪酸含量上升幅度較大,可能是郫縣豆瓣特有的長時間“翻、曬、露”工藝,使得水分含量減少,導(dǎo)致其含量升高。

表1 不同后發(fā)酵時期郫縣豆瓣脂肪酸組成及含量(mg/g)Table 1 Fatty acid composition and contents of Pixian soybean paste at different post-fermentation stages(mg/g)

圖2 郫縣豆瓣樣品中脂肪酸組分氣相色譜圖 Fig.2 Gas chromatogram of fatty acid componentsin Pixian soybean paste samples注:1:十一碳酸甘油三酯(11.587 min);2:月桂酸甲酯(12.725 min);3:肉豆蔻酸甲酯(14.841 min);4:棕櫚酸甲酯(16.781 min);5:棕櫚油酸甲酯(17.148 min);6:硬脂酸甲酯(18.574 min);7:油酸甲酯(18.859 min);8:反式油酸甲酯(18.935 min);9:亞油酸甲酯(19.511 min);10:亞麻酸甲酯(20.427 min)。

不同后發(fā)酵期郫縣豆瓣脂肪酸,含量最高的是亞油酸(4.963～11.668 mg/g),依次是油酸(1.186～2.706 mg/g)和棕櫚酸(0.751～1.649 mg/g),這與豆豉(亞油酸55.941%、油酸21.592%、棕櫚酸13.729%)[28]的含量相似。脂肪酸含量普遍較低的是月桂酸(0.030～0.113 mg/g)、肉豆蔻酸(0.131～0.305 mg/g)、棕櫚油酸(0.056～0.142 mg/g)、反式油酸(0.126～0.230 mg/g),反式油酸和棕櫚油酸在整個后發(fā)酵期間含量變化不大,處于一個相對穩(wěn)定的狀態(tài);月桂酸和肉豆蔻酸呈起伏變化;不飽和脂肪酸亞油酸、油酸、亞麻酸呈整體下降趨勢。

在1～6 M期間,脂肪酸含量逐步下降,并在6 M處達(dá)到最低值,究其原因,一方面可能是原料蠶豆瓣中含有一定量的脂肪酸;另一方面可能是來自于微生物與酶的作用,使1 M脂肪酸含量較高。但隨著發(fā)酵的進(jìn)行,部分微生物由于不適應(yīng)新的環(huán)境或完成其代謝過程而消失[8],使得脂肪酸的形成減緩。直至發(fā)酵6 M時,“翻、曬、露”過程中大量環(huán)境微生物的進(jìn)入,使郫縣豆瓣發(fā)酵體系達(dá)到一個相對穩(wěn)定的狀態(tài),致使脂肪酸含量在此時到達(dá)最低點。

亞油酸(C18∶2)是郫縣豆瓣發(fā)酵過程中含量最豐富的多不飽和脂肪酸,相對百分比含量高達(dá)56.90%～69.60%。亞油酸可降低氧化損傷,通過與膽固醇結(jié)合,還可維持血液膽固醇正常的運轉(zhuǎn)和代謝、預(yù)防動脈粥樣硬化、糖尿病和心腦血管疾病[29-32]。此外,亞油酸和油酸不僅是必需脂肪酸,也可通過氧化、酶系作用分解生成醛類、醇類、酮類及呋喃類化合物[7],適量的油酸和亞油酸含量可顯著增加揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的組成及總量,過高則易產(chǎn)生不愉快氣味[33],對于郫縣豆瓣醬獨特風(fēng)味物質(zhì)生成具有一定貢獻(xiàn)。

2.3 不同后發(fā)酵期郫縣豆瓣脂肪酸相關(guān)性分析

為了更直觀的解釋后發(fā)酵過程中郫縣豆瓣樣品中脂肪酸的變化情況,對8個郫縣樣品9種脂肪酸成分進(jìn)行相關(guān)性分析,結(jié)果如表2所示。大部分脂肪酸含量之間存在正相關(guān)關(guān)系(僅1個負(fù)相關(guān)),且相關(guān)系數(shù)大多大于0.5,表明脂肪酸之間具有較強的正相關(guān)性。硬脂酸、油酸、反式油酸、棕櫚油酸等脂肪酸之間存在極顯著正相關(guān)(P<0.01);肉豆蔻酸與硬脂酸、油酸、反式油酸、亞油酸存在顯著正相關(guān)(P<0.05),與亞麻酸呈極顯著正相關(guān)(P<0.01);棕櫚油酸與亞油酸呈顯著正相關(guān)(P<0.05);棕櫚酸、月桂酸與其他脂肪酸均不存在顯著相關(guān)性。由于指標(biāo)之間均存在不同程度的相關(guān)性,所以可以利用主成分分析對這些變量即原始的脂肪酸含量進(jìn)行降維處理,來研究豆瓣中脂肪酸與不同后發(fā)酵時期的關(guān)系。主成分的特征值和貢獻(xiàn)率見表3。由表3可知,前2個主成分的貢獻(xiàn)率分別為75.09%、15.21%,累積貢獻(xiàn)率為90.30%,確定提取2個主成分最合適,可較好反映所有脂肪酸組成的基本信息。

表2 脂肪酸指標(biāo)間的皮爾森相關(guān)系數(shù)Table 2 Pearson correlation coefficient between fatty acid indicators

表3 主成分的特征值和貢獻(xiàn)率Table 3 Eigen values and contribution rateand of the principal components

主成分的載荷矩陣見表4。由表3和表4各特征向量值可知,第一主成分PC1主要反映C18∶1t、C18∶0、C18∶1的變異信息,故可將PC1命名為十八碳脂肪酸因子F1。第二主成分主要反映C12∶0和C16∶0的變異信息,故可將PC2命名為飽和脂肪酸因子F2。

表4 主成分載荷矩陣Table 4 Loading matrix of principal components

圖3為主成分分析得到的不同發(fā)酵期脂肪酸組分的分值圖。從圖3可以看出,不同樣品在橫、縱坐標(biāo)的距離各不相同且沒有重疊,說明8個不同后發(fā)酵期郫縣豆瓣樣品得到了較好的區(qū)分。其中,樣品在坐標(biāo)上的距離隨時間變化而變化,因而可大致將后發(fā)酵期脂肪酸的變化分為三個階段,分別為后發(fā)酵前期(1～3 M)、中期(6～9 M)、后期(12～36 M),并且隨著發(fā)酵時間的延長脂肪酸變化程度減弱,究其原因,可能是由于在后發(fā)酵前期,各種微生物與酶系的作用代謝過程較快,僅相隔一兩個月其脂肪酸含量都存在顯著差異;隨著發(fā)酵的進(jìn)行,底物的消耗及pH的降低[28]，影響發(fā)酵體系中相關(guān)酶活性及微生物產(chǎn)酶能力,導(dǎo)致后發(fā)酵中期、后期脂肪酸含量變化逐漸減緩。

圖3 郫縣豆瓣后發(fā)酵過程中脂肪酸組分的分值圖Fig.3 Score plots of fatty acid compositionduring post-fermentation of Pixian soybean paste

3 結(jié)論

郫縣豆瓣在后發(fā)酵過程中粗脂肪含量變化為3.46%～4.29%，其中飽和脂肪酸以棕櫚酸為主,不飽和脂肪酸以亞油酸、油酸為主,且不飽和脂肪酸含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于飽和脂肪酸,另外還含有少量其他種類脂肪酸如:月桂酸、亞麻酸、棕櫚油酸、硬脂酸等?；谥鞒煞址治龇?提取得到前兩個主成分貢獻(xiàn)率分別為75.09%、15.21%,累積貢獻(xiàn)率達(dá)90.30%,可較好反映所有脂肪酸組成的基本信息。脂肪酸含量在后發(fā)酵期的變化可大致分為三個階段,依次分別為1～3、6～9、12～36 M,可稱為后發(fā)酵前期、發(fā)酵中期和發(fā)酵后期。在發(fā)酵過程中,一些不飽和脂肪酸還可氧化分解為揮發(fā)性香味物質(zhì),對后發(fā)酵過程中香氣成分的變化具有潛在影響。相對于郫縣豆瓣中其他呈香呈味物質(zhì)(氨基酸、有機酸),部分發(fā)酵節(jié)點上脂肪酸的含量相對稍高。本研究結(jié)果為郫縣豆瓣工業(yè)化生產(chǎn)控制產(chǎn)品品質(zhì)與建立生產(chǎn)質(zhì)量控制體系提供了科學(xué)依據(jù)。同時脂肪酸還是一些霉菌的代謝物質(zhì),要系統(tǒng)闡明發(fā)酵過程中脂肪酸的代謝通道，還需結(jié)合發(fā)酵過程中參與轉(zhuǎn)化的真菌細(xì)菌進(jìn)一步研究。