高 宇,畢保良,孔令富,李紅金,王曉雯,賈 丹

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,云南昆明 650201)

2018年云南省羅非魚(Oreochromisniloticus)的養(yǎng)殖總產(chǎn)量達到15.48萬噸,超過四大家魚,位居云南省第一,占云南省淡水魚養(yǎng)殖總量的26%[1]。云南省羅非魚主要以初級加工產(chǎn)品羅非魚片和冷凍羅非魚出口為主,深加工產(chǎn)品很少[2]。在魚片生產(chǎn)過程中會產(chǎn)生約占魚重10%的碎肉,目前大部分碎肉被制備成魚粉飼料,經(jīng)濟附加值較低。張萍[3]利用碎肉來制備生化試劑蛋白胨,也有學(xué)者采用酶水解法來制備蛋白質(zhì)水解液[4]或者活性肽[5]。因此如何合理高效地利用羅非魚碎肉,是目前羅非魚加工副產(chǎn)物利用亟待解決的主要問題之一。

魚糜制品是近幾年我國發(fā)展最為迅速的水產(chǎn)深加工產(chǎn)品之一,已有研究將羅非魚碎肉加工成熱誘導(dǎo)或酸誘導(dǎo)魚糜凝膠制品。目前熱誘導(dǎo)凝膠制品技術(shù)已經(jīng)相當(dāng)成熟且關(guān)于熱誘導(dǎo)凝膠及其凝膠形成機制的報道較多[6-7]。關(guān)于酸誘導(dǎo)凝膠的研究主要集中在葡萄糖酸內(nèi)酯(glucono-δ-lactone,GDL)在低溫條件下誘導(dǎo)魚糜凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成上。GDL在高水分體系中分解為葡萄糖酸和內(nèi)酯,葡萄糖酸能使體系pH降至蛋白質(zhì)等電點,使顆粒間的排斥力轉(zhuǎn)變?yōu)槲?在低溫條件下長時間交聯(lián)導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集形成凝膠[8-9]。Riebroy等[10]研究發(fā)現(xiàn)大西洋鱈魚(Gardusmorhua)的肌動球蛋白添加GDL后,室溫放置48 h可以形成蛋白凝膠。鄭嚴(yán)等[11]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)GDL添加量為2.1%、酸化溫度為35 ℃、酸化時間2.0 h可以制備高凝膠強度、冷藏即食的真鯛(Pagrusmajor)魚糜凝膠制品。鰱(Hypophthalmichthysmolitrix)肌動球蛋白在4 ℃長時間的酸誘導(dǎo)條件下可以形成凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),且其凝膠強度隨GDL含量的增加而提高[12]。但目前鮮有關(guān)于GDL對羅非魚碎肉凝膠特性影響方面的研究報道。實驗前期研究發(fā)現(xiàn),獲得品質(zhì)較高的低溫羅非魚碎肉蛋白凝膠,最適GDL添加量為2.4%,但交聯(lián)時間對酸誘導(dǎo)羅非魚碎肉凝膠特性的影響還有待研究。

因此,本研究以羅非魚碎肉為原料,研究酸誘導(dǎo)蛋白在低溫交聯(lián)過程中的化學(xué)作用力及凝膠特性的內(nèi)在聯(lián)系,旨在揭示酸誘導(dǎo)羅非魚碎肉在低溫交聯(lián)過程中的凝膠形成機制,以期為高品質(zhì)的低溫凝膠化產(chǎn)品在生產(chǎn)工業(yè)中的應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羅非魚(Oreochromisniloticus)碎肉 云南新海豐水產(chǎn)科技集團有限公司;葡萄糖酸內(nèi)酯(GDL) 北京索萊寶科技有限公司;2,4,6-三硝基苯磺酸、二硫代硝基苯甲酸 Sigma公司。

TA-XTPlus物性分析儀 英國Stable Micro System公司;TU-1800紫外-可見光分光光度計 北京普析通用儀器公司;高速冷凍離心機 美國貝克曼庫爾特有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 魚糜凝膠的制備 將冷凍的羅非魚碎肉在4 ℃冰箱解凍12 h,去掉雜質(zhì)、黑膜、結(jié)締組織,用5倍質(zhì)量的自來水漂洗2次,再用5倍0.5% NaCl溶液漂洗1次,每次漂洗10 min,添加魚糜質(zhì)量2.5%的NaCl斬拌,再添加魚糜質(zhì)量2.4%的GDL和去離子水使魚糜水分含量達到80%,混合均勻后擠入直徑3.5 cm的聚偏二氯乙烯腸衣中,放置于4 ℃條件下,交聯(lián)時間分別為0、5、10、15、20和24 h,到達交聯(lián)時間后,去掉腸衣立即取樣。

1.2.2 魚糜凝膠自由氨基含量的測定 參考文獻[13],并修改如下:2 g魚糜凝膠溶解于18 mL硼酸緩沖液,均質(zhì),于75 ℃水浴15 min,60 ℃水浴2 h,4000×g離心5 min后取0.25 mL上清液,加2 mL磷酸緩沖液和2 mL 0.1%的2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid solution,TNBS),混勻,于50 ℃水浴60 min(錫箔避光),后用4 mL 0.1 mol/L HCl終止反應(yīng),室溫冷卻30 min 后,于340 nm測定其吸光值。標(biāo)準(zhǔn)曲線采用L-亮氨酸制作,標(biāo)曲為y=0.1089x+0.0412,R2=0.9921。

1.2.3 魚糜凝膠二硫鍵含量的測定 參考Dan等[14]的方法。取2 g魚糜凝膠分散在20 mL的Tris-甘氨酸緩沖液中(pH8.0,含0.086 mol/L Tris,0.09 mol/L甘氨酸,0.004 mol/L乙二胺四乙酸(EDTA)和8 mol/L尿素),12250×g下離心10 min,取上清液待用,并同時用Lowry法測定蛋白濃度。

測定游離巰基SHF含量時,移取200 μL二硫代硝基苯甲酸[(5,5′-Dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)]Ellman’s添加到4 mL的蛋白上清液中,室溫下反應(yīng)1 h,于412 nm測定其吸光值。

測定總巰基SHT含量時,1 mL蛋白上清液中加入4 mL 20 mmol/L Tris-Gly緩沖液于40 ℃水浴1 h,然后用20%的三氯乙酸(TCA)沉淀蛋白1 h,4000×g離心10 min,收集沉淀用20%的TCA漂洗3次,沉淀用l0 mL的Tris-甘氨酸緩沖液溶解。取200 μL的Ellman’s試劑添加到4 mL的蛋白溶液中,于412 nm測定其吸光值。

SHT、SHF含量根據(jù)公式(1)計算分別得到,S-S含量根據(jù)公式(2)表示:

SH(μmol/g protein)=73.53A412/c

式(1)

S-S(μmol/g protein)=(SHT-SHF)/2

式(2)

式中:c:蛋白濃度,mg/mL;A412:412 nm處的吸光值;73.53:106/13600,13600 mol·cm/L為摩爾消光系數(shù)。

1.2.4 魚糜凝膠化學(xué)作用力的測定 參考Ni等[15]的方法。取2 g魚糜凝膠分別與10 mL的0.05 mol/L NaCl(SA)、0.6 mol/L NaCl(SB)、0.6 mol/L NaCl+1.5 mol/L尿素(SC)和0.6 mol/L NaCl+8 mol/L尿素(SD)混合并均質(zhì)。于4 ℃靜置1 h,然后于12096×g離心15 min。用Lowry法測上清液中蛋白質(zhì)的含量。離子鍵的貢獻以溶解于SB溶液中的蛋白質(zhì)與溶解于SA溶液中的蛋白質(zhì)的含量之差表示,氫鍵的貢獻以溶解于SC溶液中的蛋白質(zhì)與溶解于SB溶液中的蛋白質(zhì)的含量之差表示,疏水相互作用力的貢獻以溶解于SD溶液中的蛋白質(zhì)與溶解于SC溶液中的蛋白質(zhì)的含量之差表示。

1.2.5 魚糜凝膠強度的測定 除去腸衣,將魚糜凝膠切成直徑為20 mm的圓柱體,平衡至室溫,用質(zhì)構(gòu)儀進行穿刺實驗。采用P/0.25S型號的探頭對樣品進行一次壓縮,壓縮距離為15 mm,測前速度為1 mm/s,測試速度為1 mm/s,測后速度為1 mm/s,測試過程中出現(xiàn)的第一個峰值為破斷強度,峰值所對應(yīng)的壓縮距離為凹陷深度,破斷強度與凹陷深度的乘積即表示凝膠強度[16]。

1.2.6 魚糜凝膠Texture Profile Analysis(TPA)參數(shù)的測定 參考殷俊等[17]的方法并略作修改。除去腸衣,將魚糜凝膠切成直徑為10 mm的圓柱體,并置于質(zhì)構(gòu)儀探頭正下方的樣品臺上,采用P/36R型號的探頭,測前速度為1 mm/s;測中速度為1 mm/s;測后速度為1 mm/s;采用70%的壓縮比例進行測試。選取彈性、硬度(kg)、粘聚性、咀嚼度(kg)和回彈性作為TPA參數(shù),參數(shù)定義和計算方法參照Cardoso等[18]的報道。硬度表征魚糜凝膠能承受的最大力;彈性和回彈性則表征魚糜凝膠的彈性及形變后的恢復(fù)能力;粘聚性表征魚糜凝膠的粘性;咀嚼度則表征魚糜凝膠的咀嚼的難易程度,值小則咀嚼性差,值過大則難咀嚼,其值適中則適口性較好。

失水率(%)=(m1-m2)×100/m1

式(3)

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實驗重復(fù)3次,數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示,均采用GraphPad Prism.V5.0軟件(GraphPad Software Inc.,La Jolla,USA)作圖,采用SAS 8.0 軟件(SAS Institute,Cary,North Carolina,USA)進行統(tǒng)計與分析。檢測實驗數(shù)據(jù)正態(tài)分布和方差齊性后,進行單因素方差分析(One-way ANOVA),然后用Duncan檢驗比較各樣本數(shù)據(jù)之間的差異顯著性,顯著性水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫交聯(lián)時間的酸誘導(dǎo)魚糜凝膠自由氨基的影響

低溫交聯(lián)時間對酸誘導(dǎo)羅非魚魚糜凝膠自由氨基含量的影響如圖1,在低溫條件下,隨著交聯(lián)時間的延長,自由氨基含量顯著降低(P<0.05),而交聯(lián)時間在5～10 h時魚糜凝膠的自由氨基含量之間沒有顯著性差異,當(dāng)交聯(lián)時間為15～24 h自由氨基含量顯著下降(P<0.05)。說明在低溫條件下的酸誘導(dǎo)凝膠形成過程中,5～10 h交聯(lián)時間內(nèi)生成的γ-羧酰胺基和伯胺發(fā)生交聯(lián)鍵的數(shù)量顯著高于0 h(P<0.05),而15～24 h交聯(lián)時間內(nèi)生成的γ-羧酰胺基和伯胺發(fā)生交聯(lián)鍵的數(shù)量顯著高于0～10 h(P<0.05)。這是因為賴氨酸是谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶(TGase)交聯(lián)反應(yīng)的底物之一,TGase可以催化γ-羧酰胺基和伯胺發(fā)生交聯(lián)反應(yīng),導(dǎo)致自由氨基含量降低。因此賴氨酸含量(通過測定自由氨基而得)的變化通常用來表示TGase催化交聯(lián)反應(yīng)的程度,自由氨基含量越低,說明γ-羧酰胺基和伯胺發(fā)生交聯(lián)鍵的數(shù)量越多[20]。

圖1 低溫交聯(lián)時間對酸誘導(dǎo)羅非魚魚糜凝膠自由氨基的影響Fig.1 Effect of low temperature crosslinking timeon free amino group of tilapia surimi gel induced by acid注:不同大寫字母標(biāo)注表示不同時間處理存在顯著差異(P<0.05);圖2～圖6同。

2.2 低溫交聯(lián)時間對酸誘導(dǎo)魚糜凝膠游離巰基(SHF)、總巰基(SHT)、二硫鍵(S-S)含量的影響

低溫交聯(lián)時間對酸誘導(dǎo)羅非魚魚糜凝膠SHF、SHT和S-S的影響如圖2。低溫酸誘導(dǎo)過程中,隨著交聯(lián)時間的延長,SHF含量隨著交聯(lián)時間的延長而下降,20～24 h交聯(lián)時間內(nèi)的SHF含量顯著低于0～15 h(P<0.05),而SHT在5～24 h交聯(lián)過程中含量沒有顯著的變化(P>0.05),S-S含量隨著交聯(lián)時間的延長而增加,在20 h達到最高。前期研究發(fā)現(xiàn),2.4% GDL作用魚糜24 h后,因GDL水解成葡萄糖酸使得魚糜pH下降到4.37(數(shù)據(jù)未呈現(xiàn))。故在低溫條件下,蛋白質(zhì)酸變性導(dǎo)致更多的SHF被氧化成S-S。S-S是半胱氨酸和胱氨酸的巰基被氧化生成的分子內(nèi)和分子間的化學(xué)鍵。在蛋白質(zhì)分子中巰基是最具活性的功能基團,巰基存在于肌球蛋白分子內(nèi)部,當(dāng)肌球蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,暴露出SHF,這些SHF就會發(fā)生氧化反應(yīng)形成S-S[21]。

圖2 低溫交聯(lián)時間對酸誘導(dǎo)羅非魚魚糜凝膠游離巰基(SHF)、總巰基(SHT)、二硫鍵(S-S)的影響Fig.2 Effects of low temperature crosslinking timeon free sulfhydryl,total sulfhydryl,disulfide bond oftilapia surimi gel induced by acid

2.3 低溫交聯(lián)時間對酸誘導(dǎo)魚糜凝膠化學(xué)作用力的影響

低溫交聯(lián)時間對酸誘導(dǎo)魚糜凝膠化學(xué)作用力的影響如圖3。由圖3可知,隨著交聯(lián)時間的延長,羅非魚碎肉凝膠的氫鍵含量顯著降低。離子鍵含量呈先下降后上升趨勢,但整體來看,在低溫交聯(lián)過程中,酸誘導(dǎo)凝膠體系中離子鍵所占比例最小,疏水相互作用所占的比例最大,且隨著低溫交聯(lián)時間的延長,呈現(xiàn)先增后減的趨勢,且疏水相互作用促進了酸誘導(dǎo)凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成。蛋白凝膠中,溶解于SA和SB溶液中的主要是肌動蛋白、原肌球蛋白、肌鈣蛋白及一些低分子量的蛋白質(zhì)[22],由此可知,在低溫酸誘導(dǎo)凝膠形成過程中,這些蛋白通過比非特異性結(jié)合、離子鍵更強的化學(xué)作用力存在于蛋白凝膠中,故在低溫交聯(lián)過程中,非特異性結(jié)合和離子鍵含量隨著交聯(lián)時間的延長而降低(24 h對應(yīng)的離子鍵含量除外),且氫鍵含量也隨著交聯(lián)時間的延長而顯著下降(P<0.05)。這說明非特異性結(jié)合、離子鍵和氫鍵不是維持低溫酸誘導(dǎo)凝膠體系的主要化學(xué)作用力。這可能是在凝膠形成過程中,離子鍵和氫鍵參與肌球蛋白分子尾部的纏繞,而不參與頭部的聚集[23]。在酸處理過程中,離子鍵和氫鍵開始斷裂,蛋白變性,疏水基團開始暴露,體系產(chǎn)生疏水相互作用,造成肌球蛋白分子聚集。同時二硫鍵和γ-羧酰胺基和伯胺發(fā)生交聯(lián)鍵也開始形成,最終形成致密性較強的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

圖3 低溫交聯(lián)時間對酸誘導(dǎo)羅非魚魚糜凝膠非化學(xué)作用力的影響Fig.3 Effect of low temperature crosslinking time on the non-covalent bonds of tilapia surimi gel induced by acid注:a:非特異性結(jié)合;b:離子鍵;c:氫鍵;d:疏水相互作用。

2.4 低溫交聯(lián)時間對酸誘導(dǎo)魚糜凝膠特性的影響

2.4.1 低溫交聯(lián)時間對酸誘導(dǎo)魚糜凝膠強度的影響 低溫交聯(lián)時間對酸誘導(dǎo)羅非魚魚糜凝膠強度的影響如圖4。隨著交聯(lián)時間的延長,碎肉魚糜凝膠的破斷強度在24 h顯著高于5～15 h(P<0.05),但15和20 h的凝膠的破斷強度無顯著性差異(P>0.05),這說明24 h魚糜凝膠中蛋白質(zhì)分子間的緊實程度顯著高于5～15 h,而15和20 h凝膠的緊實程度無差異。凹陷深度在交聯(lián)5～20 h無顯著性差異,但24 h時凝膠的凹陷深度顯著低于15～20 h(P<0.05),這表明交聯(lián)24 h后魚糜凝膠的彈性較15～20 h相比反而有所下降。魚糜凝膠的凝膠強度在20 h顯著高于交聯(lián)5～15 h(P<0.05)。這是因為GDL水解形成葡萄糖酸,促進蛋白酸變性,且隨著交聯(lián)時間的延長,低溫條件下酸誘導(dǎo)過程中γ羧酰胺基和伯胺發(fā)生交聯(lián)鍵、二硫鍵和疏水相互作用使得蛋白之間聚集從而形成了高強度的凝膠。魚糜凝膠的破斷強度和凝膠強度均在20～24 h達到最高,但長時間的交聯(lián)(24 h)會使得蛋白凝膠的凹陷深度下降。

圖4 低溫交聯(lián)時間對酸誘導(dǎo)羅非魚魚糜凝膠強度的影響Fig.4 Effects of low temperature crosslinking timeon gel strength of tilapia surimi gel induced by acid

2.4.2 低溫交聯(lián)時間對酸誘導(dǎo)魚糜凝膠TPA性能的影響 由圖5可以看出,在低溫過程中,隨著交聯(lián)時間延長,硬度、咀嚼度和回彈性都呈現(xiàn)先增后減的趨勢,當(dāng)交聯(lián)時間為20 h時,魚糜凝膠的硬度達到最高,說明20 h時魚糜凝膠能承受的外力最強。而咀嚼度在15～20 h時達到最高?；貜椥栽?0 h達到最高,說明10h時魚糜凝膠形變后的恢復(fù)能力最強。隨著交聯(lián)時間的延長,回彈性呈下降趨勢,但整體來看,10～20 h時魚糜凝膠恢復(fù)形變的能力顯著(P<0.05)高于5和24 h的。而彈性隨著交聯(lián)時間的延長呈現(xiàn)上升的趨勢,但在10～24 h無顯著性差異(P>0.05)。粘聚性隨著交聯(lián)時間的延長無顯著性差異,而長時間的交聯(lián)(24 h)反而使得粘聚性有所下降。綜合魚糜凝膠的破斷強度、凹陷深度和凝膠強度指標(biāo),為了獲得較好的魚糜凝膠特性,最佳的低溫交聯(lián)時間為20 h。

圖5 低溫交聯(lián)時間對酸誘導(dǎo)羅非魚魚糜凝膠質(zhì)構(gòu)的影響Fig.5 Effect of low temperature crosslinking time on gel texture of tilapia surimi gel induced by acid

2.5 低溫交聯(lián)時間對酸誘導(dǎo)魚糜凝膠失水率的影響

魚糜凝膠失水率與持水性成負(fù)相關(guān),失水率越小,凝膠持水性能越好。蛋白凝膠的持水性與極性氨基酸結(jié)合水的能力、水分子分布、凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)等因素有關(guān)[24-25]。由圖6可知,當(dāng)交聯(lián)時間在0～10 h之間,魚糜凝膠的失水率無顯著性差異(P>0.05),隨著交聯(lián)時間的增加,失水率呈現(xiàn)顯著上升趨勢(P<0.05)。說明隨著交聯(lián)時間的延長,凝膠的持水性下降。整體來說,酸誘導(dǎo)凝膠持水性都低于熱誘導(dǎo)魚糜凝膠,通常加熱魚糜凝膠的持水性與凝膠強度存在正相關(guān)關(guān)系[26],但本研究發(fā)現(xiàn)酸誘導(dǎo)魚糜凝膠的持水性和凝膠強度的變化并沒有呈現(xiàn)正相關(guān)。在低溫過程中,酸誘導(dǎo)凝膠形成過程中持水性的下降,可能是因為蛋白內(nèi)部的疏水基團會逐漸暴露出來,疏水相互作用在酸凝膠中起主導(dǎo)作用,結(jié)果導(dǎo)致凝膠中的蛋白分子結(jié)合水分子的能力下降,從而降低了凝膠的持水性[27]。

圖6 低溫交聯(lián)時間對酸誘導(dǎo)羅非魚魚糜凝膠失水率的影響Fig.6 Effect of low temperature crosslinking timeon the expressible moisture of tilapia surimi gel induced by acid

3 結(jié)論

本研究表明,羅非魚碎肉在2.4% GDL誘導(dǎo)蛋白凝膠形成過程中,最佳的低溫交聯(lián)時間為20 h。在低溫酸誘導(dǎo)過程中,γ-羧酰胺基和伯胺產(chǎn)生的交聯(lián)鍵、二硫鍵和疏水相互作用使得碎肉蛋白之間發(fā)生交聯(lián)從而形成了高強度的凝膠。蛋白凝膠的質(zhì)構(gòu)特性隨著交聯(lián)時間的延長而增加,但持水性隨著交聯(lián)時間的延長而下降。這一結(jié)果為后續(xù)開發(fā)高品質(zhì)的低溫凝膠化產(chǎn)品提供了重要依據(jù)。