吳雍真，陳云志，朱 星，杜海洋，李 倩，柴藝匯

貴州中醫(yī)藥大學(xué)(貴州 貴陽 550025)

骨質(zhì)疏松(Osteoporosis，OP)是以單位體積內(nèi)骨基質(zhì)含量減少、骨密度降低、骨組織微細(xì)結(jié)構(gòu)退化為特征的代謝性骨病。隨著人口老齡化加速，OP的發(fā)病率不斷攀升，并被世界衛(wèi)生組織認(rèn)為是除冠心病外的主要健康問題[1]。OP易導(dǎo)致患者出現(xiàn)腰背全身疼痛、呼吸功能下降、身長縮短、駝背，嚴(yán)重者還可出現(xiàn)骨折、脊柱變形等癥狀，影響患者生活質(zhì)量[2]。近年來，通過中醫(yī)藥治療OP的研究發(fā)現(xiàn)[3-4]，中醫(yī)學(xué)重視辨證論治、內(nèi)外并重，不僅療效良好、副作用低，還可減輕患者痛苦、提高生活質(zhì)量。中醫(yī)雖無明確記載，但根據(jù)OP的臨床表現(xiàn)可將其歸屬“骨痹”、“骨痿”等范疇，“腎藏精，主骨，為先天之本”，骨藏髓，髓充骨，精血可生養(yǎng)骨髓，精、血均由腎精所化，故認(rèn)為腎精虧虛是引起OP的重要因素。

黃芪(Astragalusmembranaceus)為豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根，具有補氣升陽，斂瘡生肌，利尿消腫，固表止汗，補益腎氣等功效[5-6]。黃芪藥理作用廣泛，除具有抗感染、免疫調(diào)節(jié)、保護肝腎等臟器和調(diào)節(jié)血壓外，還具有抗骨質(zhì)疏松生物活性[7]。相關(guān)研究表明[8]黃芪總黃酮提取物可有效改善維甲酸致OP大鼠模型的骨密度[8]；同時，黃芪多糖可通過促進成骨細(xì)胞增殖，達到防治OP的作用[9]。因此，黃芪具有一定防治OP的藥理基礎(chǔ)。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)涉及多個學(xué)科的技術(shù)與知識，可多方位揭示藥物治療疾病的潛在作用機制，為研究中藥或復(fù)方有效活性成分、作用靶點、潛在機制等提供有效研究策略。前期通過中醫(yī)理論依據(jù)、基礎(chǔ)實驗研究發(fā)現(xiàn)黃芪具有防治OP的作用，但對黃芪的藥效作用物質(zhì)基礎(chǔ)與機制闡釋尚不明確。鑒于此，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，篩選藥物的活性成分及黃芪防治OP的潛在靶點，構(gòu)建“藥物-活性成分-靶蛋白-疾病”網(wǎng)絡(luò)，對靶點進行富集分析，探討其潛在作用機制，為后續(xù)實驗提供科學(xué)依據(jù)。

1 方法

1.1篩選黃芪有效活性成分與OP靶蛋白通過TCMSP(http://tcmspw.com/tcmsp.php)數(shù)據(jù)庫搜集黃芪的化學(xué)成分；以口服生物利用度(OB)≥30%，藥物相似度(DL)≥0.18為標(biāo)準(zhǔn)，篩選黃芪有效活性成分，并查詢有效活性成分相對應(yīng)的靶點。在GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)、CTD數(shù)據(jù)庫(http://ctdbase.org/)獲得OP相關(guān)靶點。所得化合物的靶點與OP靶點取交集，使用Cytoscape v 3.7.2軟件構(gòu)建藥物-活性成分-靶蛋白-疾病可視化聯(lián)系。

1.2構(gòu)建蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)將交集得到靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)，構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)(PPI)互作網(wǎng)絡(luò)。將Degree從大到小排序，以前30為標(biāo)準(zhǔn)篩選核心靶點。

1.3GO功能富集分析和KEGG富集分析將1.2篩選出的核心靶點導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov),以人類為研究對象進行GO(gene ontology)注釋和KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路富集分析，將P值設(shè)為小于0.01。其中GO分析包括生物過程(BP)、細(xì)胞成分(CC)和分子功能(MF)。

2 結(jié)果

2.1黃芪有效成分及靶蛋白分析通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索關(guān)鍵詞“黃芪”獲得成分87個，通過相關(guān)條件篩選得到黃芪有效成分20個，見表 1，并查詢獲得有效活性成分相對應(yīng)的靶點，剔除4個未查詢到靶點的活性成分，結(jié)果顯示16個活性成分共對應(yīng)210個靶點。在GeneCards、CTD數(shù)據(jù)庫檢索關(guān)鍵詞“Osteoporosis”，篩選得到相應(yīng)靶點后取并集，刪除重復(fù)項后獲得OP相關(guān)靶點。將篩選獲得的有效活性成分對應(yīng)的靶點與OP相關(guān)靶點取交集，獲得64個靶點分別對應(yīng)15個活性成分。利用Cytoscape軟件建立“藥物-活性成分-靶蛋白-疾病”網(wǎng)絡(luò)(見圖 1)。Degree排前5的有效活性成分為槲皮素(quercetin)、山萘酚(kaempferol)、異鼠李素(isorhamnetin)、刺芒柄花素(formononetin)、毛蕊異黃酮(Calycosin)，這些可能為黃芪治療OP的關(guān)鍵有效成分，見表2。

圖1 黃芪治療OP的“藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)

表1 TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選出黃芪有效成分

表2 關(guān)鍵有效成分

2.2構(gòu)建蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)將重合的64個靶點導(dǎo)入String作PPI網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)共有64個節(jié)點，603條邊，見圖2，根據(jù)Degree大小排列，取前30篩選為核心靶點，見圖3。將核心靶點對應(yīng)的有效成分與2.1所得的5個可能為黃芪治療OP的有效成分取交集，結(jié)果顯示交集與之前5個有效成分相同，故推測，槲皮素、山萘酚、異鼠李素、芒柄花黃素、毛蕊異黃酮可能是黃芪治療OP的關(guān)鍵有效成分。

圖2 黃芪治療OP靶點PPI網(wǎng)絡(luò)

圖3 Degree前30個靶蛋白

2.3基因功能與通路富集分析通過DAVID數(shù)據(jù)庫對黃芪治療OP的30個潛在作用的核心靶點進行分析，根據(jù)P<0.01，共得到120個GO注釋，52條KEGG通路。按P值大小，篩選出前20個GO注釋，見表3，表中GO注釋9個與BP有關(guān)，9個與MF有關(guān)，2個與CC有關(guān)，GO注釋大多與BP和MF相關(guān)，如酶結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ?qū)D(zhuǎn)錄的正調(diào)控作用、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、對藥物的反應(yīng)等。

KEGG結(jié)果顯示，30個核心靶點共富集在52條通路上，主要集中在癌癥信號通路、乙型肝炎、腫瘤壞死因子(TNF-α)信號通路、催乳素信號通路、人嗜T淋巴細(xì)胞病毒I型感染、軍團菌病、病毒性心肌炎、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號通路、低氧誘導(dǎo)因子(HIF-1)信號通路、Toll樣受體信號通路、胰島素抵抗等。按P值大小，排列前20條通路，見圖4。

表3 黃芪治療OP核心靶點GO注釋

圖4 黃芪治療OP核心靶點KEGG富集通路分析

3 討論

骨形成、骨重塑主要與成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞密切相關(guān)，機體維持正常骨穩(wěn)態(tài)有賴于二者的協(xié)同作用，而當(dāng)骨形成與骨吸收失衡，則會導(dǎo)致骨量、骨質(zhì)產(chǎn)生變化，進而造成OP[10]。OP的發(fā)病與性別、年齡關(guān)系密切，流行病學(xué)研究顯示[11]我國50歲以上OP患病率女性為20.7%，男性為14.4%，且隨年齡增長而呈上升趨勢。目前治療OP的藥物主要分為骨形成促進劑、骨吸收抑制劑兩大類，但長期使用此類藥物可出現(xiàn)眾多不良反應(yīng)[12]，故研發(fā)更安全高效的藥物成為亟待解決的問題。近年來，眾多實驗及臨床觀察均證實黃芪對OP具有良好的療效，但對其有效成分與機制尚不明確。本研究在TCMSP數(shù)據(jù)庫共篩選出20個黃芪有效活性成分。對“藥物-活性成分-靶蛋白-疾病”網(wǎng)絡(luò)分析，根據(jù)Degree值排序前5種有效成分為槲皮素、山萘酚、異鼠李素、刺芒柄花素、毛蕊異黃酮，故推測這些可能為黃芪治療OP的關(guān)鍵有效成分。槲皮素為多羥基黃酮類化合物，具有抗病毒、抗腫瘤、保護肝臟等生物學(xué)活性。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)[13]，槲皮素可調(diào)節(jié)骨代謝，抑制破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收、誘導(dǎo)破骨細(xì)胞凋亡及增強成骨細(xì)胞活性，也可促進OP模型大鼠成骨細(xì)胞分化，調(diào)節(jié)骨代謝改善OP。山奈酚為黃酮醇類化合物，不僅有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗腫瘤等生物學(xué)活性，還具有提高成骨細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶活性，促進成骨細(xì)胞增殖分化，增加骨形成的作用。同時實驗也證實[14]，山奈酚可增加骨小梁數(shù)目、增高去勢大鼠骨密度，有效改善OP。異鼠李素為槲皮素在體內(nèi)的代謝形式，與槲皮素是共生黃酮。相關(guān)研究顯示[15]，異鼠李素可改善去勢大鼠的骨微結(jié)構(gòu)破壞，具有防治OP的作用。此外，對刺芒柄花素、毛蕊異黃酮藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)二者均具有抗OP作用[16-17]。上述研究與本研究結(jié)果呈現(xiàn)一致性，提示槲皮素、山萘酚、異鼠李素、刺芒柄花素、毛蕊異黃酮5個活性成分可能在黃芪治療OP中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

根據(jù)Degree分析PPI網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果顯示白介素-6(IL-6)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(CASP)3、血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)等30個靶點可能在黃芪治療OP過程中起關(guān)鍵作用。IL-6生物學(xué)功能復(fù)雜，不僅是炎癥免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)因子，也在骨代謝過程中發(fā)揮重要作用，其可干擾堿性磷酸酶的活性，并且IL-6過表達與包括OP在內(nèi)的多種疾病的病理過程有關(guān)，例如IL-6和其受體的過表達對成骨細(xì)胞分化具有拮抗作用[18]。IL-6還被認(rèn)為是經(jīng)典的骨吸收促炎細(xì)胞因子，不僅可通過接觸破骨細(xì)胞前體刺激破骨細(xì)胞的形成，還可通過刺激成骨細(xì)胞表達核因子-κB受體活化因子配體(RANKL)來促進破骨細(xì)胞生成，破壞骨代謝平衡[19]。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)家族在細(xì)胞凋亡過程中起重要作用，Caspase-3為凋亡效應(yīng)子，位于Caspase家族介導(dǎo)的蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)的下游；Caspase-8是死亡受體途徑的關(guān)鍵因子，與凋亡啟動子Caspase-9同為啟動型蛋白酶，位于級聯(lián)反應(yīng)的上游。相關(guān)實驗發(fā)現(xiàn)，骨質(zhì)疏松患者成骨細(xì)胞的Caspase-3、Caspase-9的表達水平高于正常組，并且動物實驗結(jié)果也顯示與對照組比較Caspase-3、Caspase-8在OP模型大鼠中的表達水平顯著上調(diào)，而給予OP模型大鼠黃芪等中藥組成的復(fù)方治療可有效改善OP并下調(diào)Caspase-3、Caspase-8表達水平[20-21]，提示黃芪治療OP的機制可能與下調(diào)Caspase-3、Caspase-8有關(guān)。VEGF為促有絲分裂因子，分為VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD和VEGFE，其中VEGFA被認(rèn)為是傳統(tǒng)意義上的VEGF。研究顯示[22]，VEGF除是血管生長因子外，還是在骨代謝過程中發(fā)揮重要作用的骨生長因子。通過檢測體內(nèi)VEGF的表達發(fā)現(xiàn)，在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者體內(nèi)的VEGF水平遠(yuǎn)低于正常人。動物實驗也證實[23]，利用表達VEGF的腺病毒載體注入新西蘭兔股骨遠(yuǎn)端可顯著增加骨量及成骨細(xì)胞的數(shù)量。此外，其余靶點與OP也存在密切關(guān)系，如雌激素受體1(ESR1)、ESR2參與骨細(xì)胞的代謝，絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、核轉(zhuǎn)錄因子kappaB(NF-κB)可通過調(diào)控細(xì)胞增殖和分化、炎癥相關(guān)信號通路，直接或間接影響OP。

GO功能富集分析結(jié)果提示黃芪治療OP可能是通過調(diào)控酶結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ?qū)D(zhuǎn)錄的正調(diào)控作用、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、對藥物的反應(yīng)等基因功能有關(guān)。KEGG通路富集分析，發(fā)現(xiàn)靶點主要富集在癌癥信號通路、乙型肝炎信號通路、TNF信號通路、催乳素信號通路、人嗜T淋巴細(xì)胞病毒I型感染、軍團菌病、病毒性心肌炎、PI3K/Akt信號通路、HIF-1信號通路、Toll樣受體信號通路、胰島素抵抗等通路上。其中顯著性最高的癌癥信號通路較為復(fù)雜，具有多個下游通路，如Wnt信號通路、過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)信號通路、MAPK信號通路、VGEF信號通路等[24]。Wnt蛋白為分泌型糖蛋白，在成骨細(xì)胞分化中起關(guān)鍵作用，也是調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞活性的關(guān)鍵因子[25]。實驗發(fā)現(xiàn)[26]，黃芪甲苷可通過調(diào)節(jié)去勢大鼠骨組織Wnt2蛋白表達水平達到改善OP的作用。PPAR-γ與骨代謝關(guān)系密切，若PPAR-γ處于長期激活的狀態(tài)下則會導(dǎo)致骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化，使成骨細(xì)胞減少影響骨形成[27]。c-Jun氨基末端激酶(JNK)、p38MAPK為MAPK信號通路的重要成員，研究發(fā)現(xiàn)[28]JNK通路可影響成骨細(xì)胞的分化，在骨形成中具有重要作用；p38通路可促進成骨細(xì)胞生成并對破骨細(xì)胞的分化具有抑制作用。PI3K/Akt信號通路廣泛存在于多種組織中，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡等生物學(xué)作用，并且PI3K/Akt信號通路及其下游靶蛋白在骨重建、骨形成過程中起重要作用[29]。其它顯著性高的通路如TNF信號通路、HIF-1信號通路、Toll樣受體信號通路、胰島素抵抗通路等均可通過直接或間接影響機體骨代謝[30]。

綜上所述，本研究初步驗證和預(yù)測黃芪治療OP的分子機制，發(fā)現(xiàn)黃芪治療OP有效成分及作用機制呈現(xiàn)多成分、多靶點、多通路的特性，為后續(xù)深入研究其具體機制提供了思路和基礎(chǔ)。