王文婷，施展，林向輝，林曉熙，劉喜峰，任珅，李偉※

（1.吉林農業(yè)大學中藥材學院，吉林 長春 130118；2.遼寧熙峰藥業(yè)集團有限公司，遼寧 桓仁 117000）

免疫力是人體自身的防御機制，是維持機體內環(huán)境穩(wěn)定的重要保障，其作用體現在當人體自身受細菌、病毒或病原體入侵時，自身免疫系統所具有的抵抗能力[1]，也是評價機體抵抗疾病的關鍵屏障。一旦免疫力低下或抵抗能力異常，其侵襲的病原體將直接影響機體內環(huán)境，從而感染疾病，因此增強免疫力變得尤為重要。增強免疫力通常通過一定手段來加強自身免疫力，也是許多藥物治療疾病或者改善臨床藥效的目的之一，近年來大量研究表明天然藥物在增強機體免疫力方面有著非常顯著的效果[2]。

人參為五加科人參屬（Panax ginseng C.A.Meyer）植物的干燥根及根莖，是我國極具傳統特色的中藥資源，具有藥用和營養(yǎng)雙重價值，素有“百草之王”美譽[3]，其性甘、味微苦，歸脾、肺、心經；具有安神益智、大補元氣和補脾益肺之功效，久服可以增強其自身免疫力[4]。其主要化學成分為人參皂苷，還包括人參多糖、氨基酸和黃酮類等多種化學成分[5]，是發(fā)揮人參多重藥理作用的物質基礎。近年來，隨著人參被列為新資源食品，其食用價值逐漸得到人們的廣泛關注，人參系列產品應運而生，例如今幸人參膠囊和人參飲料等。根據人參獨特的加工方法和藥用價值，蒸參水和人參須等加工產品也逐步得到應用，進一步豐富了人參的開發(fā)價值。同時，利用人參精深加工產品，提高機體防御能力和抗病毒能力，更符合現代“以食為養(yǎng)、以食為療”的養(yǎng)生理念。因此，開發(fā)人參功能性食品對于促進人參相關制品的深度開發(fā)具有重要的現實意義。

膏劑不僅是傳統中成藥的主要劑型之一，而且是功能性食品的首選劑型。根據機體不同體質及臨床反應，通過煎熬等方式并加入某些輔料制成一種稠膏狀劑型，可充分體現膏劑治療、滋補和易于吸收的特點。鮮人參膏（fresh ginseng paste,FGP）利用國家發(fā)明專利技術[6]，精選優(yōu)質新鮮人參，利用鮮人參不同部位的加工方法，以蒸須水為溶劑，并配以紅棗精華，科學加工，轉化稀有活性物質，成功富集出以Rg3 為代表的16 種稀有皂苷組分群，最大限度地保留了人參中所有活性成分和營養(yǎng)物質[7]，同時更富含精氨酸雙糖苷AFG、氨基酸、多糖和人參蛋白等多種有益物質[8]。

人參加工制品因其富含人參皂苷并具有顯著的生理活性，是醫(yī)療和保健的首選佳品，更能體現人參獨特的藥用和食用價值。本研究基于人參的現代研究背景，探究人參新型加工品“鮮人參膏”對環(huán)磷酰免疫抑制模型增強小鼠免疫力的作用，以期為人參功能性食品的開發(fā)提供理論基礎，進一步豐富人參系列深產品的開發(fā)利用。

1 材料與方法

1.1 儀器、材料與試劑

Neofuge 1600R 高速離心機（上海力新儀器有限公司）；SPECTRO star Nano 全波長掃描式酶標儀（德國BMG LABTECH 公司）；超凈工作臺（蘇州安泰公司）；Leica DM 500 顯微鏡（德國徠卡公司）；HERACELL 240i CO2 培養(yǎng)箱（美國Thermo 公司）。

鮮人參膏（FGP），購自遼寧熙峰藥業(yè)集團有限公司，合格證號SC10721052200667；刀豆蛋白A（Con A）、脂多糖（LPS，批號L2880），均購自美國Sigma 公司；二苯基四氮唑溴鹽（MTT），購自美國Sigma 公司；二甲基亞砜（DMSO），購自北京化工廠；小牛血清，購自杭州四季青公司；RPMI1640培養(yǎng)基；白細胞介素2（IL-2）和腫瘤壞死因子（TNF-）試劑盒，購自美國R&D 公司。

BALB/C 小鼠（雌性，20～25 g）和ICR 小鼠（雌性，18～22 g），由長春億斯實驗動物有限公司提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 動物分組 取適應性飼養(yǎng)1 周后的ICR 小鼠50 只，隨機分為正常對照組（N），CTX 免疫抑制模型組（CTX），CTX+FGP 高劑量組（600 mg/kg，FGP-H）、中劑量組（300 mg/kg，FGP-M）、低劑量組（150 mg/kg，FGP-L），FGP 用生理鹽水配制成混懸液，每天灌胃1 次，連續(xù)30 d。模型組（M）及給藥組于第1、2、3、9、16和23 天腹腔注射80 mg/kg 的CTX。

1.2.2 免疫抑制小鼠臟器指數的測定 經給藥30 d，進行小鼠眼球采血，離心并分離血清，做好分裝后待用。小鼠處死，收集臟器并稱重，計算其胸腺指數和脾臟指數。

臟器指數（%）=臟器重量（g）/體重（g）100

1.2.3 體外淋巴細胞增殖試驗 取BALB/c小鼠處死，用75%的乙醇消毒，取出脾臟并用Hanks'液洗，研磨脾臟過200 目篩網，計數，配成2 106mL1細胞懸液待用。試驗分為空白組、陰性對照組、陽性對照組和樣品組FGP 5 個濃度，分別為FGP（12.5、25.0、50.0、100.0和200.0g/mL）。將制備好的細胞懸液除空白孔加入100L 培養(yǎng)基，其余每孔均加100L 細胞懸液于96孔板中，每組3 個重復，將96 孔板置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h后取出?？瞻捉M和陰性對照組中各加入100L培養(yǎng)基，陽性對照組濃度加入10LCon A（50g/mL）置于37℃、5% CO2 孵箱中培養(yǎng)48 h 后取出，每孔加20L MTT（5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后，吸去上清，加入150L DMSO 充分溶解，使用酶標儀測定各孔OD值（490 nm）。

1.2.4 淋巴細胞轉化試驗 在制備脾細胞懸液的基礎上，進行淋巴細胞轉化試驗，其小鼠處理方法與“1.2.3”相同，試驗共分3 組進行：第1 組脾細胞自然轉化，不加刺激劑；第2 組加入Con A 刺激T 細胞轉化；第3組加入LPS 刺激B 細胞轉化。試驗分為空白孔、自然轉化孔、Con A刺激孔和LPS 刺激孔，每孔設3 個復孔。將各組細胞分別加入96 孔板中，空白孔和自然轉化孔分別加入100L 培養(yǎng)液，ConA刺激孔加入100L 濃度為5.0g/mL Con A，LPS 刺激孔加入100L 濃度為10.0g/mL 的LPS[9]。按照上述方法測定MTT。

1.3 數據處理

試驗數據均用Mean±SD 表示，采用單因素方差分析法（ANOVA）進行統計分析，采用GraphPad Prism 6.0.4 軟件進行方差分析并繪圖。P＜0.05 或P＜0.01認為有統計學差異。

2 結果與分析

2.1 FGP對CTX致免疫抑制小鼠臟器指數的影響

在試驗過程中，正常對照組和試驗組小鼠生長狀況良好。如表1 所示，與正常對照組相比，免疫抑制模型組胸腺指數與脾臟指數均明顯降低（P ＜0.05）。與免疫抑制模型組相比，低、中和高劑量FGP 組胸腺指數以及脾臟指數降低情況均有明顯改善（P ＜0.05），表明FGP 具有增強小鼠免疫力的作用。

表1 FGP 對CTX 致免疫抑制小鼠臟器指數的影響Table 1 Effect of FGP on organ index of CTX-induced immunosuppressed mice

2.2 FGP 對體外小鼠淋巴細胞轉化的影響

FGP 給藥組選用5種不同的給藥濃度（12.5、25.0、50.0、100.0 和200.0g/mL）作用于小鼠淋巴細胞48 h后，采用MTT 法檢測了不同濃度FGP 對小鼠淋巴細胞的細胞毒性，結果如圖1 所示：隨著FGP 濃度的逐漸增加，BALB/c 小鼠淋巴細胞轉化率逐漸升高，且呈現出較明顯的劑量依賴（圖1）。

2.3 FGP 對CTX 致小鼠淋巴細胞轉化率的影響

小鼠FGP 連續(xù)灌胃30 d，刺激劑為Con A 和LPS，FGP 對CTX 致小鼠淋巴細胞轉化率的影響如圖2 所示。從圖2 可以看出，低、中劑量FGP 組與CTX 組相比均有顯著差異（P ＜0.05），高劑量FGP 組與CTX 組相比小鼠淋巴細胞轉化率明顯提高（P ＜0.01），表明FGP 能夠提高淋巴細胞的自然轉化。

圖1 FGP 對體外小鼠淋巴細胞轉化的影響Fig.1 Effects of FGP on transformation of spleen lymphocytes in mice

2.4 FGP對CTX致小鼠血清中IL-2和IFN-水平的影響

如圖3 所示，與正常對照組（N）相比，CTX組小鼠血清中IL-2 與IFN-含量均顯著降低（P ＜0.05）；低劑量FGP 組（FGP-L）小鼠血清中IL-2 和IFN-含量有一定的升高，但與CTX 組相比無顯著差異。與CTX組相比，中劑量FGP 組（FGP-M）血清中IL-2 和IFN-含量均有顯著提高（P ＜0.05）。高劑量FGP 組（FGPH）的IL-2 含量與CTX 組相比極顯著升高（P ＜0.01）；高劑量FGP 組（FGP-H）的IFN-含量與CTX 組相比顯著升高（P ＜0.05）。

圖2 FGP 對CTX 致小鼠淋巴細胞轉化率的影響Fig.2 Effects of FGP on transformation rate of lymphocytes in mice induced by CTX

圖3 FGP 對CTX 致小鼠血清中IL-2 和IFN- 含量的影響Fig.3 Effects of FGP on IL-2 and IFN- contents in serum of miceinduced by CTX

3 討論

本研究基于環(huán)磷酰免疫抑制模型研究了鮮人參膏增強小鼠免疫力的作用，結果表明，FGP 能夠增強BALB/c 小鼠淋巴細胞的體外轉化，在給藥30 d 后小鼠胸腺指數及脾臟指數明顯提高。隨著FGP濃度的升高，小鼠淋巴細胞的轉化率也隨之升高，呈現出一定的劑量依賴關系，也表明高劑量FGP組淋巴細胞的轉化率相對較高；低、中劑量FGP在促進免疫抑制小鼠淋巴細胞轉化上均起到顯著的促進作用；中、高劑量FGP 能夠明顯提高免疫抑制小鼠血清中IL-2和IFN-的水平。

CTX是目前常用的抗腫瘤藥物，也是臨床上常用的免疫抑制藥物，能通過抑制細胞增殖達到治療各種自身免疫性疾病的效果[10]。通過CTX 可以建立小鼠免疫抑制模型，而導致其機體免疫功能下降的原因涉及T 細胞、B 細胞異常分化等諸多方面。本試驗主要針對CTX 誘導的免疫抑制模型，通過觀察與免疫相關的器官和指標，探究不同濃度的FGP 對小鼠機體免疫功能的影響。胸腺是T細胞分化成熟的場所，同時也是機體的中樞免疫器官；脾臟是機體最大的外周免疫器官，當抗原刺激機體后，免疫細胞（T 細胞、B 細胞和巨噬細胞）過度增生，導致其體積增大；二者均為機體的主要免疫器官[11]。淋巴細胞轉化率是評價細胞免疫功能的一個重要指標，淋巴細胞只有向成熟T 淋巴細胞轉化才能發(fā)揮免疫效應[12]。IL-2 是免疫系統中的一類細胞生長因子，對于細胞免疫應答具有明顯的促進作用，是細胞免疫水平的一個重要指標[13]；IFN-是細胞被病毒感染時產生的一類細胞因子，在細胞免疫過程中，高劑量的IFN-起抑制作用，而低劑量的IFN-起促進作用，其調節(jié)免疫功能主要通過巨噬細胞的激活來實現[14-15]。

人參是我國一種珍貴的滋補性藥物資源，紅棗更具有“天然維生素”的美譽，而FGP 是將人參與紅棗二者加工并通過獨特專利技術制成的，富含16 種稀有皂苷及其多種活性物質，為其強大的藥理活性提供了物質保證[5]。人參中發(fā)揮免疫調節(jié)作用的主要是人參皂苷Rg3和Rh2，人參皂苷具有增強其自身的免疫活性分子和改善免疫抑制作用，從而增強其自身免疫力[16]。本試驗探究了FGP對CTX 誘導的免疫抑制作用，結果發(fā)現FGP能夠明顯減輕CTX 造成的免疫損傷，有效改善小鼠免疫力低下，從而增強其免疫應答能力。這充分說明FGP 在體內灌胃給藥以及體外淋巴細胞轉化過程中均起到了顯著的保護作用，并產生干擾素，以增強小鼠的免疫調節(jié)能力。本研究闡述了FGP 對CTX 誘導免疫損傷具有很好的拮抗作用，初步揭示了鮮人參膏具有較強的免疫調節(jié)能力，可為人參及相關產品的精深開發(fā)提供理論依據。