唐麗昕，張然然，劉華淼，邢秀梅

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所特種經(jīng)濟(jì)動物分子生物學(xué)重點實驗室，吉林 長春 130112）

梅花鹿鹿茸是一種傳統(tǒng)名貴中藥材，在我國已沿用兩千多年，其中脂質(zhì)是鹿茸的重要組成部分[1]。段傳鳳等利用薄層色譜法分離出10 種磷脂組分（溶血磷脂酰膽堿、神經(jīng)鞘磷脂、磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷酯酰絲氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、雙磷脂酰甘油和磷脂酸），利用氣相色譜法分離出10種脂肪酸（豆蔻酸、棕櫚酸、棕櫚烯酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸、花生酸、花生二烯酸和花生四烯酸），其中神經(jīng)鞘磷脂和磷脂酰膽堿含量最高[2]。

隨著脂質(zhì)研究日益受到關(guān)注，脂類代謝研究迅猛發(fā)展。2003年，Han等[4]首次提出了脂質(zhì)組學(xué)（lipidomics）概念，即針對代謝產(chǎn)物中的脂質(zhì)進(jìn)行全面系統(tǒng)研究[3]。通過脂質(zhì)組學(xué)研究可深入、全面地獲取生物中的脂質(zhì)分子信息。脂質(zhì)組學(xué)研究主要包括非靶向和靶向策略。非靶向脂質(zhì)組學(xué)策略無偏地對生物樣品中整體脂質(zhì)的變化進(jìn)行分析，最大程度地反映樣品中脂質(zhì)的變化規(guī)律和趨勢，從而找出差異標(biāo)志物[5]；靶向脂質(zhì)組學(xué)針對某一類或某幾類目標(biāo)脂質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確的定性定量分析，常用于關(guān)鍵代謝通路或靶標(biāo)的分析或驗證[6]。烏其爾·依熱格吉牧[7]利用非靶向代謝組鑒定到蘇尼特羊脂肪中171 種脂質(zhì)代謝物，并探索了不同部位脂肪組織的差異脂質(zhì)組份，劉宏艷[8]利用脂質(zhì)組學(xué)技術(shù)鑒定到山羊奶中756 種脂質(zhì)分子，并篩選到38 種脂質(zhì)分子可用于鑒別山羊奶產(chǎn)地。

鹿茸是一種動物組織器官，其脂質(zhì)組分是復(fù)雜的，利用組學(xué)技術(shù)可更深入、全面地獲取鹿茸脂質(zhì)分子信息，將有助于鹿茸藥理活性物質(zhì)的挖掘，以及不同區(qū)段茸片的鑒別。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗所需樣品為5 歲健康東北梅花鹿鮮鹿茸二杠茸（3 支）、三杈茸（3 支），采集于中國農(nóng)科院特產(chǎn)研究所左家梅花鹿養(yǎng)殖場。根據(jù)中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（NY/T 1162-2006）選取蠟片茸與血片茸。

試驗所需色譜級甲醇、乙腈、醋酸、甲醋銨和甲基叔丁基醚購自德國Merck公司。標(biāo)準(zhǔn)品購自美國Sigma公司，并用甲醇作為溶劑溶解后保存在-20℃。

1.2 儀器與設(shè)備

超高效液相色譜儀為日本島津UPLC CBM30A，串聯(lián)質(zhì)譜儀為美國AB Sciex QTRAP?6500；色譜柱為Thermo C30 柱（2.1 100 mm，2.6m），超純水系統(tǒng)為德國Merck Millipore 公司。

1.3 試驗樣品脂質(zhì)提取

稱取新鮮鹿茸樣品50±0.5 mg，置于EP 管中，加入300L冷甲醇、預(yù)冷鋼珠，20 Hz研磨3 min；加入1 mL冷MTBE（甲基叔丁基醚），置于冷水中超聲5 min；EP管中加入300L的0 ℃冰水，渦旋3 min，隨后放置于4 ℃冰箱中10 min；4 ℃、14 000 r/min 離心10 min，取上層清液，氮氣吹干，200L 乙腈/異丙醇（10/90，含0.04%乙酸，5 mmol/L 甲酸銨）復(fù)溶。將所有樣品提取物混合作為質(zhì)控樣本（QC），用于監(jiān)測分析樣本在相同處理方法下的重復(fù)性。在LC-MS-MS 分析過程中，每10 個檢測樣本中插入一個質(zhì)控樣本。

1.4 色譜與質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集

數(shù)據(jù)采集儀器系統(tǒng)主要包括超高效液相色譜和串聯(lián)質(zhì)譜。流動相：A 相為乙腈/水（60/40，含0.04%乙酸，5 mmol/L甲酸銨）；B 相為乙腈/異丙醇（10/90，含0.04%乙酸，5 mmol/L 甲酸銨）；液相梯度：0.0～3.0 min B 相20%～50%，3.0～5.0 min B 相50%～65%，5.0～9.0 min B相65%～75%，9.0～15.5 min B 相75%～90%；流動相流速0.35 mL/min，色譜柱溫度45 ℃，樣品進(jìn)樣量2L。質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集條件：電噴霧離子源溫度550 ℃，質(zhì)譜電壓5 500 V，簾氣35 psi，碰撞誘導(dǎo)電離參數(shù)設(shè)置為中。

1.5 質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理

基于自建靶向標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫MWDB，利用軟件Analyst 1.6.3 軟件根據(jù)檢測物質(zhì)的保留時間、子母離子對信息及二級圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行定性分析。利用Multi Quant軟件對質(zhì)譜下機文件進(jìn)行色譜峰的積分和校正工作，每個色譜峰的峰面積代表對應(yīng)物質(zhì)的相對含量，最后導(dǎo)出所有色譜峰面積積分?jǐn)?shù)據(jù)保存。利用R 語言進(jìn)行主成分分析（PCA）、偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）、聚類分析（Hierarchical cluster analysis，HCA）。使用SPSS 23.0 和Simca 14.1 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異分析和單變量統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 樣本質(zhì)控分析

本試驗共加入了2 個QC 樣品，其質(zhì)譜檢測總離子流圖（圖1）的疊加圖顯示代謝物檢測總離子流的曲線重疊性高，即保留時間和峰強度均一致，表明質(zhì)譜對同一樣品不同時間檢測時，信號穩(wěn)定性較好。

2.2 脂質(zhì)代謝物鑒定

利用自建靶向標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫，共檢索到752 種脂質(zhì)代謝物，15 種代謝物類別。將每個脂質(zhì)類別檢測到的所有脂質(zhì)分子進(jìn)行加合，得到脂質(zhì)的總峰面積。由2可知，梅花鹿鹿茸中磷脂酰乙醇胺豐度最高，其次為磷脂酰膽堿和甘油三酯。對梅花鹿鹿茸的752 個脂質(zhì)分子進(jìn)行主成分分析，PC1 與PC2 兩個主成分累計貢獻(xiàn)率為57.87%。利用PC1、PC2 兩個主成分得分繪制散點圖，蠟片茸與血片茸可完全分開，可見PCA分析可以把樣品中脂質(zhì)分子信息通過綜合的方式更直觀地表現(xiàn)出來（圖3）。

2.3 蠟片茸與血片茸差異脂質(zhì)組分分析

通常代謝組等數(shù)據(jù)具有“高維、高噪聲和高變異”的特點，因此，差異代謝物的篩選通常采取結(jié)合單變量統(tǒng)計分析和多變量統(tǒng)計分析的方法，可避免只使用一種統(tǒng)計分析方法帶來的假陽性錯誤或模型過擬合。正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）結(jié)合了正交信號矯正（OSC）和PLS-DA（偏最小二乘判別分析）方法，能夠?qū) 矩陣信息分解成與Y 相關(guān)和不相關(guān)的兩類信息，通過去除不相關(guān)的差異來篩選差異變量。因此OPLS-DA解釋能力更強，可更準(zhǔn)確地篩選出組間差異。

圖1 QC 樣本質(zhì)譜檢測總離子流圖（TIC 圖）的疊加圖Fig.1 The total ion chromatograph(TIC)of QC sample by mass spectrometric detection

圖2 梅花鹿鹿茸脂質(zhì)含量分析Fig.2 Analysis of lipid content in sika deer antler

圖3 PCA 得分圖Fig.3 PCA score

首先采用OPLS-DA 方法對T45 vs T65（圖4 a），M65 vs T65（圖4 b），M45 vs M65（圖4 c），M45 vs T45（圖4 d）四個比較組進(jìn)行判別分析。交叉驗證結(jié)果均顯示R2 ＞Q2 ＞0.9，表明判別效果較好（圖4）。同時，采用單因素方差分析，篩選顯著差異表達(dá)脂質(zhì)分子。共篩選到133 種差異脂質(zhì)（VIP＞1，P＜0.05，差異倍數(shù)＞2），包含了7 個類別，具體為58 種甘油三脂，22 種磷脂酰膽堿，7 種磷酯酰絲氨酸，35 種磷脂酰乙醇胺，2 種溶血磷脂酰膽堿，5 種溶血磷脂酰乙醇胺，4 種神經(jīng)酰胺（圖5，圖6）。從熱圖中可以看出相比于其他樣品M65 中的甘油三酯含量下調(diào)，磷酯酰絲氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿在T45 與T65 含量較高。另外3 種磷脂酰乙醇胺也在T45 與T65 中含量較高，分別為

LPE（0∶0/16∶0）、LPE（0∶0/16∶1）、LPE（0∶0/18∶0），而LPE（0∶0/20∶4）、LPE（0∶0/22∶5）在M45 與M65中含量較高。而3 種神經(jīng)酰胺在M45 與M65 中顯示出較高的含量，分別為Cer（d18∶1/16∶0）、CerS（d18∶1/24∶0）、Cer（d18∶1/24∶1）。盡管T45 與T65的脂質(zhì)組分含量較為相近，到仍篩選到5 種顯著差異組分，且皆為甘油三脂，TG（14∶0/20∶1/20∶4）、TG（14∶0/20∶4/22∶2）、TG（14∶0/20∶3/22∶3）、TG（18∶1/18∶3/20∶3）、TG（16∶0/20∶4/22∶3）。而且由熱圖可以看出，M45 與M65 最大的脂質(zhì)差異組分也為甘油三脂。

圖4 各組OPLS-DA 得分圖Fig.4 OPLS-DA score

圖5 各組差異脂質(zhì)分子數(shù)量統(tǒng)計Fig.5 Statistics on the number of lipid molecules in different groups

圖6 133 種差異脂質(zhì)分子表達(dá)量熱圖Fig.6 Heat maps of 133 different lipid molecules

3 討論

鹿茸是一種名貴的中藥材，具有壯腎陽、益精血、強筋骨、調(diào)沖任、托瘡毒等功效。質(zhì)譜技術(shù)的不斷發(fā)展，不僅為鹿茸有效活性成分的挖掘提供了有利的技術(shù)支撐[9-14]，而且也為鹿茸產(chǎn)品的鑒別提供了新的思路[15,16]。

本研究利用UPLC-MS-MS 技術(shù)對二杠茸、三杈茸的蠟片茸與血片茸脂質(zhì)組分進(jìn)行了分析。共獲得了752 種脂質(zhì)組分，其中磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿、甘油三酯是梅花鹿鹿茸主要的脂質(zhì)成分，而且蠟片含量均高于血片，這與之前的研究結(jié)果一致[17]。PCA 結(jié)果顯示不僅蠟片與血片區(qū)分明顯，而且二杠茸與三杈茸的血片也出現(xiàn)明顯的分離。

OPLS-DA 與單因素方差分析結(jié)果顯示有7 個類別的脂質(zhì)化合物發(fā)生了顯著差異表達(dá)。磷脂酰膽堿，磷脂酰乙醇胺，磷脂酰絲氨酸屬于甘油磷脂，是構(gòu)成細(xì)胞膜的重要生物分子，參與了多種生物調(diào)節(jié)過程。李和平[19]對不同品種鹿茸的總磷脂含量進(jìn)行分析，結(jié)果顯示不同品種鹿茸的總磷脂含量均由基部到頂部逐漸增加；王艷梅[19]的研究結(jié)果也顯示東北梅花鹿茸不同部位間總磷脂含量差異極顯著。這些脂質(zhì)分子在蠟片茸中顯示高表達(dá)，推測這些脂質(zhì)分子在鹿茸快速生長過程中起重要的調(diào)控作用。甘油三酯是動物體內(nèi)含量最多的脂類，是長鏈脂肪酸和甘油形成的脂肪分子，大部分存在于乳糜微粒和極低密度脂蛋白內(nèi)，機體可利用甘油三脂分解產(chǎn)物供給能量。梅花鹿鹿茸蠟片即鹿茸茸尖是鹿茸的生長中心，具有旺盛的生命活動，故而相比于血片需要更多的能量以維持其細(xì)胞增殖、分化等生命活動。神經(jīng)酰胺是以神經(jīng)酰胺為骨架的一類磷脂，是細(xì)胞間基質(zhì)的主要部分，在保持角質(zhì)層水分的平衡中起著重要作用，神經(jīng)酰胺含量高低與皮膚干燥程度直接相關(guān)[20-21]。另外，神經(jīng)酰胺可通過激活轉(zhuǎn)錄因子AP-1 調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)錄，引起細(xì)胞凋亡[22-23]。而且神經(jīng)酰胺衍生物可引起早期特殊核小體間DNA 破碎，這是細(xì)胞凋亡的外部特征[24]。因此推測，神經(jīng)酰胺在鹿茸血片中的高表達(dá)，可能會引起血片茸的細(xì)胞凋亡過程。

4 結(jié)論

本研究利用UPLC-MS-MS 技術(shù)對二杠茸、三杈茸的蠟片茸與血片茸脂質(zhì)組分進(jìn)行了鑒定分析，結(jié)果顯示，磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿和甘油三酯是梅花鹿鹿茸主要的脂質(zhì)成分，而且蠟片中含量較高，而神經(jīng)酰胺類化合物在血片中表達(dá)量上調(diào)。本研究不僅為鹿茸有效成分的深入挖掘提供了數(shù)據(jù)支撐，更為梅花鹿蠟片茸與血片茸鑒別體系的建立奠定了理論基礎(chǔ)。