林文文 郭曉敏 劉秀杰 趙 燕 楊 萍 梅其炳△

（1西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室 瀘州 646000；2復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院儀器測試中心 上海 201203；3陜西西岳制藥有限公司 西安 714200）

玉屏風(fēng)復(fù)方是扶正祛邪的經(jīng)典方劑，由黃芪、白術(shù)和防風(fēng)組成，具有益氣固表、健脾止汗的作用［1］。臨床用于治療慢性支氣管炎、過敏性鼻炎、哮喘和免疫系統(tǒng)疾病。其中，黃芪為君藥，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗病毒等功效；白術(shù)為臣藥，具有抗炎、抗腫瘤、促進(jìn)胃腸運(yùn)動(dòng)等作用；佐以防風(fēng)抗炎、清除氧自由基等作用［2-6］。2015 版藥典只用含量較高的黃芪甲苷作為質(zhì)量控制指標(biāo)，不能全面反映玉屏風(fēng)復(fù)方的質(zhì)量。文獻(xiàn)中皂苷類成分多為末端吸收［7-12］，用 HPLC-UV 檢測時(shí)，靈敏度不高且分析時(shí)間較長，HPLC-ELSD 法測定專屬性較差。UPLCMS 法檢測主要用于黃芪和防風(fēng)中黃酮類、皂苷類等單一類成分的測定，尚無同時(shí)測定玉屏風(fēng)復(fù)方中三味中藥有效成分的相關(guān)報(bào)道。

Thermo LTQ XL 液質(zhì)聯(lián)用儀具有快速掃描、高質(zhì)量精度和高分辨率的優(yōu)點(diǎn)，適用于正負(fù)離子同時(shí)采集，通過復(fù)合設(shè)定，根據(jù)不同目標(biāo)離子響應(yīng)差異建立不同檢測窗口。在同一色譜條件下可對(duì)玉屏風(fēng)提取物中升麻素苷（prim-O-glucosylcimifugin）、毛蕊異黃酮苷（calycosin-7-O-β-D-glucoside）、升麻素（cimifugin）、5-O-甲基維斯阿米醇苷（5-O-methylvisammioside）、芒柄花苷（ononin）、亥茅酚苷（sec-O-glucosylhamaudol）、芒柄花素（formononetin）、黃芪甲苷Ⅳ（astragaloside Ⅳ）、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ（atractylenolide Ⅲ）、黃芪皂苷Ⅱ（astragaloside Ⅱ）、黃芪皂苷I（astragaloside Ⅰ）、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ（atractylenolide Ⅱ）、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ（atractylenolide Ⅰ）等13 個(gè)成分同時(shí)定量，能夠?yàn)槿嬖u(píng)價(jià)玉屏風(fēng)復(fù)方的質(zhì)量提供參考。

材料和方法

儀器Millipore Milli-Q Advantage A10 超純水儀；Thermo LTQ XL 液質(zhì)聯(lián)用儀；Mettler Toledo MS205DU/A型分析天平；KQ-250DA型數(shù)控超聲波清洗器；CHRIST ALPHA 冷凍干燥儀。

藥品與試劑毛蕊異黃酮苷（ 批號(hào)：HC012085198）、升麻素苷（批號(hào)：HC022139198）、芒柄花苷（批號(hào)HO012089198）、黃芪甲苷（批號(hào)：HA012079198）、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ（批號(hào)：HA007049198）、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ（批號(hào)：HA007047198）等對(duì)照品均購自中國藥品生物制品檢定所；升麻素苷（批號(hào)：P1302355）、5-O- 甲基維斯阿米醇苷（批號(hào)：P1302357）、亥茅酚苷（批號(hào)：P1302356）、芒柄花素（批號(hào)：P1302358）、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ（批號(hào)：P1302354）等對(duì)照品購自寶雞市辰光生物科技有限公司；黃芪皂苷Ⅱ（批號(hào)：H-037-161216）、黃芪皂苷Ⅰ（批號(hào)：H-038-171121）等對(duì)照品購自成都瑞芬思生物科技有限公司。各對(duì)照品純度均大于98%。玉屏風(fēng)提取物（批號(hào)：Y10222、Y1024、Y1026）由陜西西岳制藥有限公司提取制備；玉屏風(fēng)顆粒（國藥準(zhǔn)字Z1093003636）購自廣東環(huán)球制藥有限公司；玉屏風(fēng)口服液（國藥準(zhǔn)字Z420200966）購自湖北濟(jì)安堂藥業(yè)有限公司；乙腈為色譜純，水為三蒸水，甲酸為優(yōu)級(jí)純。

對(duì)照儲(chǔ)備液分別精密稱取升麻素苷、毛蕊異黃酮苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、芒柄花苷、亥茅酚苷、芒柄花素、黃芪甲苷Ⅳ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、黃芪皂苷Ⅱ、黃芪皂苷Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ等13 個(gè)化合物的對(duì)照品 5.42、3.38、3.30、2.75、3.29、5.53、4.06、4.74、3.25、2.75、2.75、3.15 和 3.36 mg，分別用甲醇溶解定容至2 mL 的容量瓶中，混勻制備儲(chǔ)備液，4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

混合對(duì)照品溶液分別精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，甲醇定容，配制成含13 個(gè)對(duì)照品分別為20、20、10、20、20、5、5、10、20、10、40、10 和 10 μg/mL 的混合溶液。在檢測分析條件下所得SRM 色譜圖見圖1。

供試品溶液按玉屏風(fēng)配方精密稱取60 g 黃芪、20 g 炒白術(shù)和 20 g 防風(fēng)粉末，加入 5 L 水煮沸 2 h，趁熱過濾，再加入3 L 水煎煮1 h，合并兩次濾液，加熱濃縮，濃縮液用凍干機(jī)濃縮凍干成粉末。精密稱取凍干粉末，用50%甲醇水溶解配制成5 mg/mL的樣品溶液。在檢測分析條件下所得圖譜見圖2。

玉屏風(fēng)顆粒溶液精密稱取市售玉屏風(fēng)顆粒，用50%甲醇水超聲溶解30 min，冷卻后取上清液過濾，制備成20 mg/mL 的溶液。

玉屏風(fēng)口服液精密量取市售玉屏風(fēng)口服液，用50%甲醇水稀釋，制備成稀釋8 倍的稀釋溶液。

陰性對(duì)照溶液依據(jù)2015 版中國藥典，分別制備缺黃芪、缺炒白術(shù)和缺防風(fēng)的陰性樣品，再按供試品溶液制備方法操作，即得。

液相色譜條件色譜柱：ACQUITY UPLC?HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm，美國 Waters 公司）；柱溫45 ℃；流動(dòng)相A 為0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B 為乙腈；梯度洗脫（0～1.5 min，含B 1%～3%；1.5～3.0 min，含 B 3%～14%；3.0～6.5 min，含 B 14%～14%；6.5～8.0 min，含B 14%～32%；8.0～9.5 min，含B 32%～35%；9.5～15.5 min，含B 35%～35%；15.5～19.5 min，含B 35%～43%；19.5～30.0 min，含B43%～43%）；進(jìn)樣量為8 μL；流速為0.5 mL/min。

圖1 玉屏風(fēng)復(fù)方中13 個(gè)對(duì)照品SRM 色譜圖Fig 1 SRM chromatograms of 13 references of Yupingfeng compound

圖2 玉屏風(fēng)復(fù)方中13 個(gè)成分的專屬性考察圖Fig 2 The specificity of 13 components in Yupingfeng compound

質(zhì)譜條件質(zhì)譜離子源為電噴霧離子化源（electrospray ionization，ESI），采用正負(fù)同時(shí)切換的選擇性離子監(jiān)測（single ion monitoring，SIM）與選擇反應(yīng)監(jiān)測（selective reaction monitoring，SRM）相結(jié)合的模式進(jìn)行含量測定，霧化氣溫度300 ℃；霧化鞘氣積流量 10.5 L/min；霧化輔助氣積流量0.15 L/min；毛細(xì)管電壓：正離子模式3.2 kV，負(fù)離子模式2.2 kV；化合物的子離子依據(jù)其母離子的碰撞誘導(dǎo)解離優(yōu)化得到，各成分檢測方式（表1）。

表1 玉屏風(fēng)復(fù)方中13 個(gè)化合物檢測方式Tab 1 Detection methods of the 13 compounds in Yupingfeng compound

結(jié) 果

專屬性取供試品溶液、空白溶液和陰性對(duì)照品溶液分別進(jìn)行專屬性考察。13 個(gè)對(duì)照品的專屬性較強(qiáng)，可進(jìn)行準(zhǔn)確定量（圖2）。

線性關(guān)系取混合對(duì)照品溶液，用50%甲醇水依次稀釋，制成梯度濃度溶液，按上述色譜方法測定。以各組分峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性考察（表2）。

穩(wěn)定性、精密度和重復(fù)性取同一供試品用溶液在 0、2、4、6、8、16、32、48 h 進(jìn)樣檢測，以峰面積計(jì)算，13 個(gè)成分和保留時(shí)間的RSD（n=6）均小于3%，表明溶液在48 h 內(nèi)穩(wěn)定。

精密稱取同一批玉屏風(fēng)提取樣品6 份，每份60 mg，用50%甲醇水溶液配置成濃度為5 mg/mL的樣品溶液。按色譜條件進(jìn)樣分析，以峰面積計(jì)算，13 個(gè)成分和保留時(shí)間的RSD 均小于3%，表明該方法重復(fù)性良好。

取同一混合對(duì)照品溶液，按上述色譜條件，在同一天連續(xù)進(jìn)樣6 次進(jìn)行日內(nèi)精密度試驗(yàn)和連續(xù)5天、每天6 次進(jìn)行日間精密度試驗(yàn)，記錄各待測物峰面積。13 個(gè)成分日內(nèi)、日間精密度和保留時(shí)間的RSD 均小于3%，表明儀器精密度良好（表3）。

加樣回收率精密稱取已測知含量的玉屏風(fēng)提取物樣品 9 份，每份 60 mg，分成 3 組，每組 3 份，分別精密添加含 13 個(gè)對(duì)照品（41.11、54.44、54.44、115.56、41.11、8.00、8.44、12.11、56.67、35.11、345.56、30.00 和 21.11 μg/mL）的混合對(duì)照品溶液0.8、1.0 和1.2 mL，按照上述方法制備供試溶液，進(jìn)行測定，計(jì)算加樣回收率為95%～105%，RDS 均小于3%（表4）。

樣品測定取3 批玉屏風(fēng)提取物（Y1022、Y1024、Y1026）和市售玉屏風(fēng)顆粒溶液、玉屏風(fēng)口服液稀釋液，按上述方法制備供試溶液，分別進(jìn)樣，記錄峰面積，并按回歸方程計(jì)算各成分含量（表5）。

表2 玉屏風(fēng)復(fù)方中13 個(gè)成分線性試驗(yàn)結(jié)果Tab 2 Results of the linearity test of the 13 components in Yupingfeng compound

表3 玉屏風(fēng)復(fù)方中13 個(gè)成分穩(wěn)定性、重復(fù)性和精密度考察Tab 3 Stability，repeatability and precision of the 13 components in Yupingfeng compound （%）

討 論

色譜條件的選擇本研究考察了甲醇-水系統(tǒng)、乙腈-水系統(tǒng)、甲醇-乙腈-水系統(tǒng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈-水系統(tǒng)干擾較小且分離效果較好，且梯度洗脫過程中基線平穩(wěn)，因此選擇乙腈-水系統(tǒng)。為了改善峰形，提高分離度，發(fā)現(xiàn)0.1%甲酸水溶液可以達(dá)到改善峰形及提高分離度的效果，且較低濃度的酸溶液有利于保護(hù)色譜柱，因此選用0.1%甲酸水溶液作為流動(dòng)相的水相。研究中先后嘗試采用多種色譜柱，優(yōu)選發(fā)現(xiàn)ACQUITY UPLC?HSS T3 分析柱所得色譜圖峰尖銳對(duì)稱，基質(zhì)干擾小，最終選定該色譜柱。

質(zhì)譜條件的選擇分別用APCI 及ESI 離子源在正、負(fù)離子模式下對(duì)玉屏風(fēng)提取物中13 種化學(xué)成分進(jìn)行檢測，大多數(shù)目標(biāo)化合物在ESI 離子源的檢測下響應(yīng)值較APCI 源高一個(gè)數(shù)量級(jí)，故選用ESI離子源進(jìn)行檢測，黃芪甲苷Ⅳ、黃芪皂苷Ⅱ、黃芪皂苷Ⅰ在負(fù)離子模式下的峰面積高于正離子模式，其余目標(biāo)化合物在正離子模式下產(chǎn)生的主要信號(hào)強(qiáng)度較負(fù)離子模式高，在此條件下對(duì)柱溫、體積流量、質(zhì)譜采集參數(shù)等進(jìn)行優(yōu)化（圖3）。

表4 玉屏風(fēng)復(fù)方中13 個(gè)成分的加樣回收率Tab 4 Recovery of the 13 components in Yupingfeng compound

《中國藥典（2015 版）》玉屏風(fēng)口服液、玉屏風(fēng)膠囊、玉屏風(fēng)顆粒等均采用黃芪∶白術(shù)∶防風(fēng)為3∶1∶1的固定比例，然而實(shí)際臨床應(yīng)用中常根據(jù)患者癥狀使用不同的調(diào)配比例以獲得更滿意的治療效果。這也提示，在質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)中僅監(jiān)控黃芪甲苷的含量不能滿足用藥監(jiān)管和安全評(píng)價(jià)的要求，大多數(shù)中藥配方要完善和提升其個(gè)性化用藥，必須把各味藥材的多種主成分作為質(zhì)量控制的關(guān)鍵。

表5 玉屏風(fēng)制劑的含量測定結(jié)果（n=3）Tab 5 Results of contents determination of Yupingfeng preparation（n=3）

圖3 APCI 和ESI 離子源優(yōu)化的比較Fig 3 Comparison of APCI and ESI in source optimization

本法采用Thermo LTQ XL 液質(zhì)聯(lián)用儀，利用其適用于正負(fù)離子同時(shí)采集，同時(shí)可以進(jìn)行切廢處理的特點(diǎn)，在同一色譜條件下利用不同檢測窗口實(shí)現(xiàn)多類組分、多個(gè)成分的同時(shí)定性、定量測定，提高了效率，使控制更為全面和精確。本法較為全面地對(duì)玉屏風(fēng)復(fù)方中的各單味藥的主要成分進(jìn)行控制，豐富了中國藥典標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)評(píng)價(jià)方法，彌補(bǔ)了其他檢測方法的局限性，在中藥質(zhì)量控制方面具有很好的應(yīng)用前景。